专利名称：八角科植物“孩儿莲”的组织培养繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种八角科植物"孩儿莲"的组织培养繁殖方法，具体涉及"孩儿莲"组
织培养过程中的外植体种类选择、初代培养方法、继代培养方法及其培养基成分。
背景技术：
八角科(Illiciaceac)为单属科植物，全世界约50种，我国有28种和2个变种， 主要分布于我国西南部至东部地区；它们为常绿小乔木或灌木，有香气，喜阴湿环境，多生 长于林间溪水边；花两性，腋生或近顶生，红色，花被片为7 21枚，花期一般在4 6月， 具一定的观赏价值。八角科植物主要靠种子繁殖，其果实大多有毒，如莽草、红茴香和地枫 皮等八角科植物的果实都具有一定毒性，致使此类植物在园林绿化上的应用受到了环境安 全因素的限制。 珍稀观赏植物"孩儿莲"为八角科八角属(Illicium Li皿.)植物，常绿小乔木，树 高约3 8m，树冠倒卵形；树皮灰褐色，单叶互生或近轮生，披针形，叶片革质化程度高，对 折易断，枝叶具特殊香味；花形莲花状，花色红润，花期在4 5月，开花时，花色红润，呈倒 挂莲花状，如同微小的灯笼，数朵挂于枝头，镶嵌于绿叶之间甚是美丽，具有很高的园林观 赏价值。尤其是"孩儿莲"在苏州地区迄今未观察到其正常结果现象，从而可以避免人畜误 食果实而造成中毒的缺陷，可广泛应用于街道、公园的绿化和庭院美化。
据《太湖备考》一书记载"孩儿莲，木似桂，花如棋子大，色状与莲花同，花不香，接 其叶嗅之，辛芬似茴。吴中向无此种，顺治间东山翁汉津为云南河西县令，携归，后为席氏所 有，珍为奇品。第花布结子，根无萌芽，欲传其种不可得，……"。虽然"孩儿莲"传入江浙 地区已有300多年的历史，但其资源极其匮乏，人工栽种的极少，目前，在苏州地区仅存数 株成年树，堪称珍稀树种。这是由于"孩儿莲"不结果实，无法收获种子；嫁接缺少砧木，扦 插繁殖成活率很低，无性繁殖困难，导致一苗难求，这些都限制了"孩儿莲"在园林绿化上的 应用。 近年来，植物组织培养技术在观赏植物上的应用越来越广泛，尤其是在自然繁育 率低的植物上的应用备受人们重视，在木本植物的组培快繁方面也已经有了一系列的成功 报道，但在八角科植物中迄今未获成功，前人对"孩儿莲"组织培养的关键技术环节也没有 进行过系统研究，其组培过程中诸如外植体污染严重、离体芽生长停止、易褐化枯死等问题 没有得到有效解决。
发明内容
本发明的目的是提供一套适用于八角科植物"孩儿莲"组织培养的外植体种类、灭 菌处理方法、初代培养方法、继代培养方法及其培养基成分，解决"孩儿莲"外植体容易污 染、"烂芯"及褐化等难题，为珍稀植物"孩儿莲"的快速繁殖提供有效的技术支持。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案是一种八角科植物——"孩儿莲"的组 织培养繁殖方法，为离体组织培养，包括如下步骤
1)以"孩儿莲"当年生枝条顶端的萌动芽为起始材料，经洗涤液浸泡、流水冲洗工 序洗净后，在室内晾干，用作组织培养繁殖的外植体； 2)将上述外植体在浓度为体积比70 75%的乙醇溶液中进行5 6秒钟的表面 处理后，在浓度为重量体积比0. 1%的HgCl2溶液中进行5 6分钟的杀菌处理，再用无菌 水充分清洗5 6次，完成对外植体的消毒灭菌处理； 3)从上述消毒灭菌后的枝条上切取芽片，接种到初代培养基上，在每天光照12 15小时，光照强度为1500 2000LX、温度为23°C ± 1°C的条件下培养，待新叶萌发后转移 到继代培养基上继续培养，得到发育正常的组培苗。 所述的初代培养基为White培养基+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—"+NAA 0. 5mg. L—、添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3X，琼脂粉浓度为 初代培养基的0. 6% ;调节pH为5. 6 5. 8。所述的继代培养基为White培养基+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—"+NAA 0. lmg. L—、添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3X，琼脂粉浓度为 初代培养基的0. 6% ;调节pH为5. 6 5. 8。
本发明与现有技术相比具有下列优点 1、本发明使用的植物材料为"孩儿莲"，它在某些地区表现为只开花不结果，这与
其他八角科植物果实大多有毒的情况不同，采用本发明技术方案提供的"孩儿莲"组培苗，
可作为一种观赏植物新品种，在园林绿化中的应用具有更好的安全性。 2、本发明提出的技术方法具有简便易行、可操作性及重现性好的特点。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述 实施例分别采用"孩儿莲"当年生枝条顶端的未萌动芽和萌动芽为起始材料，进 行对比试验。将上述两种材料经洗涤液浸泡、流水冲洗后，分别用浓度为体积比75%的乙醇 溶液中进行5秒钟的表面处理后，在浓度为重量体积比0. 1 %的HgCl2溶液中进行6分钟的 杀菌处理，最后用无菌水清洗5 6次，置滤纸上吸干多余水分，在芽体下侧切取外植体接 种于培养基。 培养结果是，"孩儿莲"未萌动芽的培养效果较差，易产生内源性污染，褐化率较高 为22. 2 46. 9% ，而存活率较低，仅为2. 8 6. 2% 。其次，在采用萌动芽为外植体的场合， 用0. 1% HgCl2溶液灭菌处理3分钟时，污染率高达100% ;灭菌时间为9分钟时，虽然未见 污染，但芽体茎尖死亡率达33. 3%，褐化率达50. 0% ;而灭菌6分钟时，污染率仅为8. 3%， 存活率可高达91. 7%。由此表明，"孩儿莲"萌动芽更适用于组培快繁的外植体材料，有利 于建立无菌培养体系。 以MS(Murashige & Skoog， 1962)为基本培养基，附加不同浓度的抗褐化剂PVP、 6-BA和NAA作为初代培养基进行比较试验。其中培养基I为MS+500mg. L—1抗褐化剂 PVP+6-BA 2. Omg. L—'+NAA 0. 5mg. L—、培养基II为l/2MS+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—丄+NAA 0. 5mg. L—、培养基III为B5培养基+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—丄+NAA 0. 5mg. L—、培养基IV为White培养基+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—'+NAA 0. 5mg. L—1 ;各培养基均添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3%，琼脂粉浓度为初代培养基的0. 6% ;调节pH 5. 6 5. 8。 培养结果是，外植体在培养基I、 II中的生长状况较差，褐化率在90%以上；在培 养基111 、 IV中，生长状况良好的外植体占80 %以上，褐化率较低。在培养基I 、 11 、 111中， 外植体下部切口都产生愈伤组织，只有培养基IV中的外植体下部切口不产生愈伤组织，且 生长状况良好的外植体比率达到了90.9%，表明培养基IV比较适合用于"孩儿莲"离体芽 的初代培养，在继代培养中也得到了相似的培养结果。 在继代培养基中，分别添加500mg. L—1和lOOOmg. L—1抗褐化剂PVP，以不添加PVP作 为对照，比较不同处理后的外植体褐化情况。结果表明，当不添加PVP时，外植体下部切口 全部褐化，继而蔓延到整个外植体；当添加lOOOmg. L—中VP时，外植体下部切口及其本身褐 化率虽有降低，但其生长发育不良；当添加500mg. L—工抗褐化剂PVP时，外植体下部切口及其 本身褐化率都很低，且生长发育良好。因此，添加500mg. L—1的抗褐化剂PVP对外植体具有 较好的抗褐化效果，且对离体芽培养的生长发育几无影响。
权利要求
一种八角科植物“孩儿莲”的组织培养繁殖方法，其特征在于，进行离体组织培养，包括如下步骤1)以“孩儿莲”当年生枝条顶端的萌动芽为起始材料，经洗涤液浸泡、流水冲洗工序洗净后，在室内晾干，用作组织培养繁殖的外植体；2)将上述外植体在浓度为体积比70～75％的乙醇溶液中进行5～6秒钟的表面处理后，在浓度为重量体积比0.1％的HgCl2溶液中进行5～6分钟的杀菌处理，再用无菌水充分清洗5～6次，完成对外植体的消毒灭菌处理；3)从上述消毒灭菌后的枝条上切取芽片，接种到初代培养基上，在每天光照12～15小时，光照强度为1500～2000LX、温度为23℃±1℃的条件下培养，待新叶萌发后转移到继代培养基上继续培养，得到发育正常的组培苗。
2. 根据权利要求1所述的八角科植物"孩儿莲"的组织培养繁殖方法，其特征在于所 述的初代培养基为White培养基+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—"+NAA 0. 5mg. L—、 添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3% ，琼脂粉浓度为初代培养 基的0. 6% ;调节pH为5. 6 5. 8。
3. 根据权利要求1所述的八角科植物"孩儿莲"的组织培养繁殖方法，其特征在于所 述的继代培养基为White培养基+500mg. L—1抗褐化剂PVP+6-BA 2. Omg. L—"+NAA 0. Img. L—、 添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3% ，琼脂粉浓度为初代培养 基的0. 6% ;调节pH为5. 6 5. 8。
全文摘要
本发明公开了一种八角科植物“孩儿莲”的组织培养繁殖方法。它以“孩儿莲”当年生枝条顶端的萌动芽组织培养繁殖的外植体，先在乙醇溶液中进行表面处理，再在HgCl2溶液中进行杀菌处理，然后，从枝条上切取芽片，接种到初代培养基上，在每天光照12～15小时，光照强度为1500～2000LX和温度为23℃±1℃的条件下培养，待新叶萌发后转移到继代培养基上继续培养，得到组培苗。本发明解决了目前“孩儿莲”资源极少，不结果实，无法收获种子，无性繁殖困难，种苗奇缺的问题，采用组织培养法可以加快繁殖速度，为满足新品种苗木市场需求提供一条新的途径，增添了一种作为珍稀观赏植物新类型，在园林绿化中具有良好应用前景。
文档编号A01H4/00GK101743909SQ20091023266
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者刘文倩, 周伯岳, 方向明, 王海玲, 苏媚, 谈建中, 阚雪芹, 颜世和 申请人:苏州大学