专利名称：一株可产生铁载体防治植物病害的拮抗细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可产生铁载体的植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。
背景技术：
植物内生细菌(endophytic bacteria)是定埴在健康植物的各种组织和器官中，与植物之间形成互恵共存、相互制约的和谐联合关系的ー类微生物(Kloepper，1992)，且它 们的存在不会使植物组织的表型特征和功能有明显的改变。1926年Perotti在许多健康植物根组织内发现内生细菌后，内生菌的研究有了很大的进展。内生细菌可在植物体内长期定殖，可通过产生抗生素、水解酶类等抗菌活性物质在植物体内长期发挥生防作用；其不易受环境条件的影响，如温度、渗透势、紫外线等；对寄主植物有促生、防病、内生固氮等多方面的有益生物学作用；另外，它还是良好的外源基因载体。植物内生细菌可在植物体内长期定殖和传导，利用拮抗内生细菌防治植物病害有几个优点首先，内生细菌占据有利于生防的生态位，分布在植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护作用，不易受外部恶劣环境如強烈日光，紫外线，风雨等的影响，具有稳定的生态位，更易发挥生防作用。其次，可与病菌直接相互作用，内生细菌系统地分布于植物根、茎、叶、花、果实、种子等的细胞间隙或细胞内，其可以产生拮抗物质直接抑制病原菌的致病因子或病原菌本身。第三，可作为外源基因的载体，利用内生细菌的侵染定殖成功向植物体内转入外源杀虫和防病基因，提高植物的抗病能力，发挥生防作用，而植物本身的基因未发生改变，可以保持植物的天然性状。近年来，利用植物内生菌进行植物病害的生物防治已经成为人们研究的热点。植物内生细菌存在多种防病作用机制，主要包括分泌抗菌活性物质、营养和生态位的竞争、增强植物的抗逆性和诱导植物系统抗性等。铁是一切生命体不可或缺的必需元素，铁质营养是农业环境中微生物和植物生长的重要限制因子。在低铁环境下，某些微生物能够产生ー种特殊的能与铁结合的有机化合物，称为铁载体(又名嗜铁素)，特异地螯合Fe3+，并以特异的转运系统将铁转移到体内，满足微生物自身的生长需要，从而使环境中的铁浓度被降低，这样病原微生物由于缺乏铁而不能生长繁殖，进而达到控制植物病害的目的。橡胶是全球重要的エ业原料和战略物资。目前对各种橡胶树病害的防治很大程度上依赖于化学农药的使用，由此带来的环境污染、农药残留、施药机械等诸多问题已引起人们广泛关注。橡胶树根病是由不同类型真菌寄生橡胶树根部所引起的。我国已发现7种真菌引起橡树根病，毎年我国因根病造成的损失达3. 36亿元。橡胶树根病是我国橡胶产业效益提高的重要障碍。到目前为止，根病的防治主要是采取挖沟隔离、药剂灌根等防治措施。挖沟隔离只能起预防作用，不能挽救已经感染根病的橡胶树，而且耗时费力，难以大范围实施。用于灌根的药剂长期以来使用的药剂对橡胶树根病防效不错，但存在成本高、长期使用对胶林土壤生态不安全等缺点。应用内生细菌防治橡胶树根病在国内外还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株可产生铁载体防治植物病害的拮抗细菌。本发明所提供的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CzklCGMCC No. 4408。枯草芽孢杆菌Czkl，已于2010年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 4408。在LB培养基(酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH7. 0)平板上菌落呈浅黄白色，近圆形，表面干燥，有褶皱，不透明。显微镜下观察，菌株菌体杆状，产芽孢，无荚膜，革兰氏反应为阳性。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408最适培养基为基础培养基；最适培养时间为24h，最适pH值7. 5，最适温度范围为26 39°C，最适温度为33°C。以上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要时，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。实验证明，本发明的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408菌株对橡胶树红根病菌、褐根病菌、紫根病菌、白根病菌、臭根病菌等根病菌都有非常强的拮抗作用；除此之外，还对热带作物上常见的病原真菌如橡胶炭疽菌、芭蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、芒果蒂腐菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、稻瘟病菌等8种病原真菌都有很强的拮抗作用，具有对这些病原菌引起的真菌病害起到生防作用的潜力。本发明的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Czkl分离自橡胶树根木质部，是ー株橡胶内生细菌。为橡胶根病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czkl是ー株具良好生防应用前景的菌株。
图I :枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408和橡胶树红根病菌的对峙培养试验结果(图中左、右两边分别为红根病菌菌株及与Czkl对峙培养拮抗情况)图2 :枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408和橡胶树褐根病菌的对峙培养试验结果(图中左为不同褐根病菌，右为对峙培养拮抗情況)。图3 :枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408和橡胶树白根病菌(RL-001)、紫根病菌(Hc-OOl)、臭根病菌(Sc-OOl)的对峙培养试验结果(图中左为不同根病病菌，右为对峙培养拮抗情况)。图4:枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408和热带作物上8种常见病原真菌的对峙培养试验結果。图5 :枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Czkl CGMCC No. 4408 在 LB 平板上的形态；右图Czkl菌株在CAS检测平板上产生橘黄色嗜铁素螯合圈)
图6 :枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408致死温度的测定结果其中左中分别为CK、60°C、70°C、8(rC、9(rC、10(rC处理后平皿上Czkl菌落生长情况；右中分别为91°c -99°c处理后Czkl菌落生长情況。图 7 :枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Czkl CGMCC No. 4408 产铁载体实验(Czkl菌株在CAS检测平板上产生橘黄色嗜铁素螯合圈)。
具体实施例方式
下述实施方案中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
I.植物病原真菌拮抗菌的筛选Czkl菌株是从我国海南省屯昌县中坤农场橡胶树根部分离到的。具体方法为在无菌的工作台上分別剪取直径为0. 5cmX0. 5cm大小的根木质块，用75%酒精+0. 1%升汞的混合液进行表面消毒，无菌水清洗3次后，移植到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，在28°C温箱中培养，连续观察7天，挑取菌落形态不同的菌株，再次划线纯化保存备用。按5点接菌法在倒好的PDA培养基平板中央接入橡胶树根病菌及热带作物常见病原菌(本实验室保存)，内生细菌接种于平板四周，筛选抑菌作用最強的菌株。结果得到一株不仅对橡胶树5种根病菌拮抗作用很强，而且对试验的8种热带作物常见病原真菌有很强的拮抗作用的菌株，将该菌株命名为Czkl，拮抗作用结果如图1-4所示。2. Czkl菌株的种属鉴定采用常规生理生化及16s DNA序列分析对Czkl菌株进行鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌。该菌株的基本生物学特性见表I。表I. Czkl菌株的基本生物学特性
权利要求
1.枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)Czkl CGMCC No. 4408。
2.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Czkl CGMCC No. 4408在防治植物病害中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物病害为橡胶树红根病菌和/或橡胶树褐根病菌和/或橡胶树紫根病菌和/或橡胶树白根病菌和/或橡胶树臭根病菌和/或橡胶树炭疽病菌和/或芒果炭疽病菌和/或西瓜枯萎病菌和/或芒果蒂腐病菌和/或水稻稻瘟病菌和/或香蕉枯萎病菌和/或芭蕉炭疽病菌和/或辣椒枯萎病菌引起的植物病害。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物病害为橡胶树红根病菌、褐根病菌、白根病菌、臭根病菌、紫根病菌、炭疽病菌引起的橡胶树病害。
5.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Czkl CGMCC No. 4408在抑制利用铁元素营养的植物病原菌中的应用。
6.以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Czkl CGMCC No. 4408为活性成分的生物菌齐U。
全文摘要
本发明公开了一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。该植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1 CGMCC No.4408。该植物病原真菌拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1 CGMCC No.4408可以防治橡胶树红根病菌、橡胶树褐根病菌、橡胶树紫根病菌、橡胶树白根病菌、橡胶树臭根病菌、橡胶树炭疽病菌、芒果炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、芒果蒂腐病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、芭蕉炭疽病菌、辣椒枯萎病菌引起的植物病害。特别是可与橡胶树共生，在橡胶树体内稳定的生存并防治橡胶树根病菌和炭疽病菌。
文档编号A01P3/00GK102643760SQ20111004286
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月18日 优先权日2011年2月18日
发明者吴伟怀, 孙亮, 李锐, 贺春萍, 赵璐璐, 郑服丛, 郑肖兰 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所