专利名称：一种富含五味子有效成分的北虫草的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种北虫草的培养方法。
背景技术：
北冬虫夏草，又名蛹虫草[C.militarise(L. )Link]、北虫草，属子囊菌亚门(Asco mycotina)核菌纲(pyrenomycetes)球壳目(Sphaerinles)麦角菌禾斗(claviticpitaceae) 虫草属(Codyc印s)，是我国名贵中药材之一。具有催眠镇静、益肝肾、补虚损、防癌、抗癌、止血、化痰、平喘等多种功效，与人参、鹿茸并称为中药宝库中的三大补药。在《本草从新》中记载有“甘平保肺、益肾、补精髓、止血化痰”等疗效。因为虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，是唯一能同时平衡和调节阴阳的中药。北冬虫夏草主要分布在我国吉林、河北、陕西等省。其主要的化学成分药理、药效与野生冬虫夏草极为相似，经中国医学科学院药物研究分析室、中国科学院沈阳分院理化测试中心等权威部门的检测表明，北虫草的一些主要营养及药物成份如虫草素、虫草多糖、 蛋白质等还要高于冬虫夏草。据《全国中草药汇编》记载“北虫草的子实体及虫体可作为冬虫夏草入药”。因此，北虫草在药理功能及临床效果方面与野生冬虫夏草基本是一致的。现代医学研究表明，北虫草不仅含有丰富的蛋白质(含量为39. 37 %，是猪肉、牛肉、羊肉蛋白质含量的1. 8，1. 5，1. 9倍)和氨基酸，而且含有30多种人体所需的微量元素。 其中P(磷)的含量是冬虫夏草的3. 5倍，Zn(锌)、Cu(铜)、Fe (铁)三种元素的含量是观种补益药平均值的1.8，2.1和8. 8倍，Se (硒)的含量与黄芪的含量相当。中医临床上常将北虫草与各种补益中药配伍使用以达到协同增效的目的，但患者在配伍使用中药时常常因为服用量大，服用不便为由中断使用药物。因此简化中医配伍用药，提高北虫草的利用率是必须解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种富含五味子有效成分的北虫草的培养方法；目的是为了简化中医配伍用药，提高北虫草的利用率。富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，按以下步骤进行一、将北虫草菌株玉丰一号接种到PDA固体培养基上，在23°C下暗培养7d，得到活化的菌种；二、将活化好的菌种切成IcmX Icm的菌块接种到300ml的液体种子培养基中，在温度为23°C、120r/min的条件下暗培养7d，得液体菌种；三、将液体菌种用磁力搅拌器打碎并稀释250倍，然后取15ml 接种到富含五味子的北虫草固体培养基中，薄膜封口后在温度为22°C、湿度为55% 60% 的条件下暗培养6 9d，得菌丝体，然后置于光照下培养至子实体成熟，然后继续培养至子座生长到4 8cm长且表面出现橘黄色粉末状物质，进行采收，即完成富含五味子有效成分的北虫草的培养；其中步骤三中富含五味子的北虫草固体培养基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和60ml的营养液组成，400ml的瓶装量为1/4 1/3 ；所述五味子粉末的制备将五味子果粉碎后过20目筛；所述营养液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氢钾、4g的硫酸镁、200g的土豆液、Ig的维生素Bl和余量的水组成；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml，pH自然，121°C高压灭菌30min ；步骤三中光照的时间为10 12h。本发明富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，通过五味子中的成分与北冬虫夏草生长代谢间的相互作用起到提高腺苷和虫草素的含量，同时又产生了具有五味子药效成分的北冬虫夏草子实体，从而起到在使用北虫草的同时配伍了五味子。本发明产出的北虫草，能大幅度提高北虫草子实体虫草素和腺苷含量，虫草素可达0. 774%，腺苷可达0. 0258%，上述两种成分含量均高于报道的野生冬虫夏草，商品价值很高；并且本发明产出的北虫草子实体中含有五味子醇甲0. 007mg/g和五味子酯甲 0. 055mg/g，从而起到将五味子有效成分转移至北虫草子实体中的目的，简化了中医学中北虫草与五味子配伍的方法，并提高了北虫草的营养和药用价值；另外，实施条件容易达到， 能在全行业推广。
图1为具体实施方式
四中HPLC法测定北虫草中腺苷含量的对照品谱图，其中曲线1表示腺苷；图2为具体实施方式
四中HPLC法测定北虫草中虫草素含量的对照品谱图， 其中曲线2表示虫草素；图3为具体实施方式
四中培养所得富含五味子有效成分的北虫草中腺苷和虫草素含量的谱图，其中曲线1表示腺苷，曲线2表示虫草素；图4为具体实施方式
四中HPLC法测定北虫草中五味子的有效成分含量的对照品谱图，其中曲线1为五味子醇甲，曲线2为五味子酯甲，曲线3为五味子甲素，曲线4为五味子乙素；图5为具体实施方式
四中培养所得富含五味子有效成分的北虫草中五味子的有效成分含量的谱图，其中曲线1 为五味子醇甲，曲线2为五味子酯甲。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，按以下步骤进行一、将北虫草菌株玉丰一号接种到PDA固体培养基上，在23°C下暗培养7d，得到活化的菌种；二、将活化好的菌种切成IcmX Icm的菌块接种到300ml的液体种子培养基中， 在温度为23°C、120r/min的条件下暗培养7d，得液体菌种；三、将液体菌种用磁力搅拌器打碎并稀释250倍，然后取15ml接种到富含五味子的北虫草固体培养基中，薄膜封口后在温度为22°C、湿度为55% 60%的条件下暗培养6 9d，得菌丝体，然后置于光照下培养至子实体成熟，然后继续培养至子座生长到4 8cm长且表面出现橘黄色粉末状物质，进行采收，即完成富含五味子有效成分的北虫草的培养；其中步骤三中富含五味子的北虫草固体培养基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和60ml的营养液组成，400ml的瓶装量为1/4 1/3 ；所述五味子粉末的制备将五味子果粉碎后过20目筛；所述营养液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氢钾、4g的硫酸镁、200g的土豆液、Ig的维生素Bl和余量的水组成；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml，pH自然，121°C高压灭菌30min ；步骤三中光照的时间为10 12h。
本实施方式步骤一中北虫草菌株玉丰一号，购买自哈尔滨玉丰菌业有限责任公
司ο本实施方式步骤二中每300ml液体种子培养基中接种1个菌块。本实施方式步骤三中暗培养6 8d的过程中，菌丝体长满整个培养基的表面并吃透培养基；且接种后前1周不通风，以后每天通风换气1 2次。本实施方式步骤三中光照下培养至子实体成熟，然后继续培养至子座生长到4 8cm长的过程为在培养中不需要去掉封口薄膜；当子实体长到2cm长，用粗针或竹签在封口薄膜上扎5 8个小洞；如子实体向一边倒，则调整光源方向，或每间隔3天转换培养基方向，以便采光均勻，保证子座正常生长到4 8cm长。本实施方式步骤三中总的培养时间为40 50h。本实施方式步骤三中采收后，将北虫草置于45°C下烘干至恒重。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中PDA固体培养基由200g的土豆液、20g的葡萄糖、18g的琼脂和IOOOml的水组成，pH自然；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml，pH自然，121°C高压灭菌30min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中液体种子培养基每L由200g的土豆液、20g的葡萄糖、Ig的硫酸镁、Ig磷酸二氢钾和余量的水组成，pH自然；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml，pH 自然，121°C高压灭菌30min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，按以下步骤进行一、将北虫草菌株玉丰一号接种到PDA固体培养基上，在23°C下暗培养7d，得到活化的菌种；二、将活化好的菌种切成IcmX Icm的菌块接种到300ml的液体种子培养基中， 在温度为23°C、120r/min的条件下暗培养7d，得液体菌种；三、将液体菌种用磁力搅拌器打碎并稀释250倍，然后取15ml接种到富含五味子的北虫草固体培养基中，薄膜封口后在温度为22°C、湿度为60%的条件下暗培养8d，得菌丝体，然后置于光照下培养至子实体成熟， 然后继续培养至子座生长到8cm长且表面出现橘黄色粉末状物质，进行采收，即完成富含五味子有效成分的北虫草的培养；其中步骤三中富含五味子的北虫草固体培养基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和60ml的营养液组成，400ml的瓶装量为1/3 ；所述五味子粉末的制备将五味子果粉碎后过20目筛；所述营养液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氢钾、4g的硫酸镁、 200g的土豆液、Ig的维生素Bl和余量的水组成；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml，pH自然，121°C高压灭菌30min ；步骤三中光照的时间为llh。本实施方式步骤一中北虫草菌株玉丰一号，购买自哈尔滨玉丰菌业有限责任公
司ο本实施方式中培养所得富含五味子有效成分的北虫草，采用HPLC法测定北虫草中腺苷和虫草素的含量步骤如下1、仪器与试药FL2200高效液相色谱仪，FL2200紫外可见波长检测器，Venusil XBP Cw色谱柱，P-20型移液枪，KQ100-DE型超声波清洗机，PL303电子精密天平；腺苷对照品(批号 110879-200202，中国药品生物制品检定所)、虫草素对照品(批号858_200202，中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯；2、方法色谱柱Venusil XBP-Q8柱(柱4. 6匪X 250匪，5 μ m，USA)；流动相甲醇-水-冰醋酸(185 14 1)；流速=ImLiirT1 ；柱温25°C ；检测波长260nm;进样量=IOyL;3、对照品溶液的制备精密称取腺苷对照品lmg，虫草素lmg，以甲醇分别制成质量浓度为lmg/mL的对照品储备液；4、供试品溶液制备精密称取本实施方式培养的北虫草样品0. 5g，加入5mL甲醇，超声提取60min后取出，冷却，以该溶剂补足减失的溶剂，以0. 45 μ m微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；5、测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10 μ L，注入高效液相色谱仪，测定，计算
含量；6、结果如图1、图2和图3所示，本实施方式中培养所得富含五味子有效成分的北虫草，在与腺苷、虫草素对照品保留时间相同的位置上含有相同的物质。采用HPLC法测定北虫草中五味子的有效成分含量步骤如下a、色谱条件色谱柱VenusilXBP-C18 柱(柱 4. 6讓X 250讓，5 μ m，USA)；流动相甲醇-乙腈-水(32 38 30)；流速=ImL · mirT1 ；柱温:25°C ；检测波长:250nm ；进样量:10yL；b、对照品溶液的制备分别精密称取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙素对照品适量，以甲醇分别制成质量浓度均为lmg/mL的对照品储备液；C、供试品溶液的制备取本实施方式培养的北虫草2g，精密称定，加入90%甲醇5mL，超声提取60min后取出，冷却，称定重量，用90 %甲醇补足减失的重量，过滤，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；d、样品测定取对照品溶液和供试品溶液以0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，分别精密吸取10 μ L进样，记录峰面积，按外标法计算含量；e、结果如图4-5所示，本实施方式中培养所得富含五味子有效成分的北虫草，在与五味子醇甲及五味子酯甲对照品保留时间相同的位置上含有相同的物质，证明按本实施方式中的培养方法生产的北虫草中含有五味子的有效成分五味子醇甲及五味子酯甲，因此在服用本实施方式中培养所得富含五味子有效成分的北虫草时可以同时也服用了五味子，从而起到简化了北虫草与五味子的配伍应用。
权利要求
1.一种富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，其特征在于富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，按以下步骤进行一、将北虫草菌株玉丰一号接种到PDA固体培养基上，在23°C下暗培养7d，得到活化的菌种；二、将活化好的菌种切成IcmX Icm的菌块接种到 300ml的液体种子培养基中，在温度为23°C、120r/min的条件下暗培养7d，得液体菌种；三、 将液体菌种用磁力搅拌器打碎并稀释250倍，然后取15ml接种到富含五味子的北虫草固体培养基中，薄膜封口后在温度为22°C、湿度为55% 60%的条件下暗培养6 9d，得菌丝体，然后置于光照下培养至子实体成熟，然后继续培养至子座生长到4 8cm长且表面出现橘黄色粉末状物质，进行采收，即完成富含五味子有效成分的北虫草的培养；其中步骤三中富含五味子的北虫草固体培养基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和 60ml的营养液组成，400ml的瓶装量为1/4 1/3 ；所述五味子粉末的制备将五味子果粉碎后过20目筛；所述营养液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氢钾、4g的硫酸镁、200g的土豆液、Ig的维生素Bl和余量的水组成；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml，pH自然，121°C高压灭菌30min ；步骤三中光照的时间为10 12h。
2.根据权利要求1所述的一种富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，其特征在于步骤一中PDA固体培养基由200g的土豆液、20g的葡萄糖、18g的琼脂和IOOOml的水组成，PH自然；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至 1000ml, pH 自然，121°C高压灭菌 30min。
3.根据权利要求1所述的一种富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，其特征在于步骤二中液体种子培养基每L由200g的土豆液、20g的葡萄糖、Ig的硫酸镁、Ig磷酸二氢钾和余量的水组成，PH自然；所述土豆液的制备200g去皮马铃薯，切块煮沸30min，纱布过滤后补足至1000ml, pH自然，121°C高压灭菌30min。
全文摘要
一种富含五味子有效成分的北虫草的培养方法，它涉及一种北虫草的培养方法。它简化了中医配伍用药，提高了北虫草的利用率。方法一、活化菌种；二、制备液体菌种；三、液体菌种打碎并稀释，接种到富含五味子的北虫草固体培养基中暗培养，得菌丝体，然后置于光照下培养至子实体成熟，然后继续培养至子座生长到4～8cm长且表面出现橘黄色粉末状物质，进行采收即完成。本发明通过五味子中的成分与北冬虫夏草生长代谢间的相互作用起到提高腺苷和虫草素的含量，同时又产生了具有五味子药效成分的北冬虫夏草子实体，从而起到在使用北虫草的同时配伍了五味子，简化了中医学中北虫草与五味子配伍的方法，提高了北虫草的营养和药用价值。
文档编号C05G3/00GK102224790SQ20111007850
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者张文艳, 杨鹏, 王双平, 王淑华, 袁斯文 申请人:王淑华