专利名称：拟南芥基因myb73在植物抗核盘病方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种拟南芥基因MYB73在抗核盘病方面的应用，尤其涉及该基因MYB73在抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)方面的应用，同时还涉及该基因MYB73在培育抗核盘菌转基因植物品种方面的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
长期以来，病原菌的侵染是造成作物产量巨大损失的主要原因。而植物不是被动的等待病原菌的侵染，而会产生一系列的抗病防御反应，如合成植物保卫素、产生水解酶及ー些抗菌蛋白来抵抗病原菌的侵入。利用分子生物学理论和技术从分子水平上研究植物和病原菌的相互作用机制为病害防治开辟了新的途径和广阔的领域，利用基因工程技术了解植物抗病的分子机制对于农业生产和人类健康均具有重要的意义。水杨酸、茉莉酸和こ烯等信号转导系统在植物细胞中广泛存在，它们參与植物的抗病胁迫反应。在细菌/活体型病原菌侵染植物时，激发植物体内水杨酸信号途径，诱导植物体内水杨酸信号途径标记基因PRl的表达；在死体型病原菌侵染植物时，激发植物体内茉莉酸信号途径，诱导植物体内茉莉酸信号途径标记基因roFl. 2的表达。研究发现，在MYB家族中，MYB30是拟南芥抗细菌的正调控因子，与植物磷脂酶相互作用(Froidure et al，2010) ；MYB72是拟南芥根部关键的调节因子，根际有益的细菌诱导MYB72表达，激发拟南芥产生抗病性(Segarra et al，2009)。本研究发现，MYB73是拟南芥抗细菌的负调控因子，同时与抗病相关基因PRl和I3DFl. 2的表达呈负相关关系，随着抗病突变体的筛选和分离，为人们认识植物抗病反应机制提供新的研究思路。现有研究表明，诱导植物体内的胼胝质沉积可以激发植物体内的基础抗病反应(Clay et al，2009)，MYB73基因是植物体内MYB转录因子家族的成员之一，在myb73突变体受到Pst DC3000侵染时，胼胝质的产量明显高于野生型，表明MYB73可以调控植物体内的胼胝质产生，但其详细机理还未见报道，因此，分析MYB73基因的功能，并研究其与抗病的关系，具有重要的理论依据和实际应用价值。
发明内容
I.本发明的目的在于提供了拟南芥基因At4g37260在植物抗核盘菌方面的应用，以拓展基因的应用范围。2.本发明提供了ー种拟南芥基因At4g37260在培养抗核盘菌转基因植物方面的应用。3.为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了拟南芥基因At4g37260的T-DNA插入突变体，研究该基因在核盘菌刺激下对抗病基因表达的影响，结果发现，该基因在植物抗核盘菌方面作用显著。4.所述的基因At4g37260编码的⑶S全长为960bp，编码320个氨基酸的蛋白，该蛋白为MYB家族的一个转录因子。
5.所述的At4g37260基因编码的蛋白在细胞内的定位未知。6.所述的At4g37260基因的突变体从拟南芥资源中心(ABRC，Ohio StateUniversity)获得。7.本发明的技术方案涉及拟南芥基因At4g37260在培育抗核盘菌转基因植物方面的应用。8.将At4g37260基因超表达获得了抗核盘菌胁迫的转基因植物。9.本发明利用从拟南芥资源中心获得At4g37260的T-DNA插入突变体，研究发现该基因对核盘菌胁迫敏感10.本发明编号为At4g37260的基因编码MYB家族的一个转录因子，该基因的超表达突变体对核盘菌不敏感，表现出显著的抗病现象。
11.本发明利用real time PCR技术检测4周龄的拟南芥(Wt)和突变体(myb73)在接种核盘菌0，12，24，36，48小时后，抗病相关基因I3DFl. 2和NPRl基因的表达变化。12.本发明通过对At4g37260基因功能的分析鉴定，确立了 At4g37260在植物抗核盘菌中的作用和调节机制，为培育抗核盘菌的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。13.本发明从拟南芥At4g37260的T-DNA插入突变体中明确该基因为抗核盘菌的相关基因，并通过超表达获得抗核盘菌的突变体，为获得抗病作物新品系提供了遗传学材料和基础。
图I为拟南芥(Wt)和突变体(myb73)接种Pst DC3000叶片发病情況。图2为Wt和myb73接种Pst DC3000叶片病菌数量变化。图3 为 Wt 和 myb73 接种 Pst DC3000 叶片的 Trypan Blue 染色。图4为Wt和myb73接种Pst DC3000叶片DAB染色。图5为MYB73基因的表达检测图6为Wt接种Pst DC3000不同时间后MYB73基因表达变化。图7为Wt接种Pst DC3000不同时间后I3DFl. 2基因表达变化。图8为Wt接种Pst DC3000不同时间后PRl基因表达变化。图9为Wt、myb73和超表达突变体OE接种Pst DC3000植株发病情况。图10为Wt、myb73和超表达突变体OE接种核盘菌植株发病情況。
图11为Wt、myb73和超表达突变体OE接种核盘菌不同时间I3DFl. 2表达情況。
具体实施例方式实施例一拟南芥抗病突变体的筛选及抗病性分析为获得抗病突变体，通过对4周龄的拟南芥接丁香假单胞杆菌(Pst DC3000) I. 5h后，利用基因芯片技术分析表达变化的基因，并在拟南芥ABRC库中获得相应基因的纯合突变体，发明人对这些纯合突变体接Pst DC3000后，发现明显抗病突变体myb73 (图I)，接菌4天后，野生型拟南芥的病菌数量为突变体的100倍(图2)，利用Trypan Blue染色法，发现接菌2天后野生型上出现大面积坏死的病斑，而突变体叶片的坏死面积明显少于野生型(图3)，利用DAB染色法，发现突变体的叶片上产生大量的胼胝质，且明显高于野生型(图4)。利用RT-PCR分析表明myb73突变体中T-DNA插入导致MYB73基因的表达量明显下调
(5)。实施例ニ抗病相关基因的表达分析将Pst DC3000 接野生型拟南芥 0、0. 5、1. 5、4、12h 后，利用 Real time-PCR 技术分析发现，接菌后MYB73基因的表达量明显下调(图6)，且在I. 5h时降至最低，这说明MYB73基因在拟南芥抗Pst DC3000过程中起负调控作用，同时发明人分析了抗病相关基因PRl和PDF1. 2的表达变化，结果发现roFl. 2基因在接菌I. 5h时表达量达到最大(图7)，PRl基因在接菌0. 5h时表达明显增加，I. 5h时也维持在ー个相当高的水平(图8)，这说明MYB73
基因与抗病相关基因PRl和I3DFl. 2的表达呈负相关关系。实施例三MYB73基因超表达突变体的表型分析MYB73基因的⑶S区首先被克隆经pMD-19 simple载体上，然后利用Xba I和BamHI将MYB73基因的CDS区切出，并应用Xba I和BamH I将MYB73基因的CDS区连接连接至载体PCAMBIA1300的Xba I和BamH I酶切位点之间。该载体含有CaMV 35S启动子，可驱动目的基因过量表达。含有MYB73基因的⑶S区的pCAMBIA1300载体利用农杆菌蘸花的方法转入拟南芥。将过量表达的myb73株系、突变体和野生型拟南芥在长日照下培养4周，用去针头的注射器接Pst DC3000菌株3天，观察其发病情況，结果如图9所示，野生型拟南芥和过表达突变体接菌的叶片均表现为明显的枯黄、萎蔫症状，而突变体只有轻微的黄化症状，这表明MYB73基因为抗病相关基因。实施例四MYB73基因的过表达突变体对核盘菌的抗病性分析如图10所示，在光/暗周期为16/8h，温度22°C，相対湿度为60%，光照强度为UOuEnT2S-1Cl的条件下生长4周后，分别对Wt、myb73和超表达突变体(OE)接种直径为5mm的核盘菌菌盘，黑暗保湿24h，2天后观察植株发病情況。试验结果显示，MYB73基因功能缺失,导致拟南芥对核盘菌更加敏感,而其超表达突变体对核盘菌抗性明显增强,这些试验结果表明MYB73是拟南芥抗核盘菌的重要基因，将MYB73超表达后，拟南芥对核盘菌的抗性增強。实施例五调节抗病相关基因表达当核盘菌侵入野生型拟南芥时诱导抗病相关基因roFl. 2表达逐渐増加，这说明死体型病原菌的侵入会诱导植物的茉莉酸信号转导途径，发病初期myb73突变体中TOF1. 2基因的表达量明显高于野生型，到48h后myb73中TOF1. 2基因的表达变为低于野生型(图11)，这说明MYB73基因的功能缺失使拟南芥降低了对核盘菌的抗性，接菌48h后拟南芥野生型被核盘菌侵入且激发抗病信号途径中I3DFl. 2基因表达迅速増加，在MYB73基因的超表达突变体中接菌48h也没有激发roFl. 2基因表达明显增加，这些结果表明MYB73基因的功能缺失导致拟南芥对核盘菌更加敏感，MYB73基因为拟南芥抗核盘菌的抗病基因。
权利要求
1.ー种拟南芥基因MYB73在植物抗核盘病方面的应用
2.根据权利要求I所述拟南芥基因MYB73在植物抗核盘病方面的应用，其特征在于所述的基因MYB73为编码一种拟南芥转录因子MYB家族的基因，该基因的CDS长度为960bp，编码320个氨基酸的蛋白。
3.根据权利要求I或2所述拟南芥基因MYB73在植物抗核盘病方面的应用，其特征在于所述的MYB73基因编码ー个拟南芥转录因子，目前该基因在细胞内的定位未知。
4.根据权利要求3所述拟南芥基因MYB73在植物抗核盘病方面的应用，其特征在于所述的MYB73基因从拟南芥资源中心(ABRC, Ohio State University)获得。
5.ー种拟南芥基因MYB73在培育抗核盘病转基因植株方面的应用。
6.根据权利要求5所述的拟南芥基因MYB73在培养抗病转基因植物方面的应用，其特征在于将MYB73基因沉默获得抗丁香假单胞杆菌/细菌的转基因植物，将MYB73基因超表达获得抗核盘菌/死体型病原真菌的转基因植物。
全文摘要
菌核病是大豆、油菜等经济作物的重要病害，造成农作物的减产甚至绝收，引发严重的经济损失。本发明筛选获得了对十字花科植物病害的核盘菌敏感突变体myb73，构建了MYB73基因(基因编号为AT4G37260)的超表达载体，通过农杆菌转化获得了该基因的超表达突变体。实验表明MYB73基因受病原菌诱导表达，负调控植物体内抗病基因的表达，调节植物体内胼胝质的产生，MYB73基因功能的分析和鉴定为获得抗核盘菌转基因植物新品种奠定了理论和生产实践基础。
文档编号A01H5/00GK102864169SQ20111019076
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者贾娇, 董金皋, 邢继红, 闫淑娟 申请人:河北农业大学