专利名称：一种驱动基因在花组织中表达的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种驱动基因在花组织中表达的启动子。
背景技术：
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，由于其具有植株小、世代时间短、基因组小等特点使其已成为一种典型的模式植物。MTO因子是含有保守MYB DNA结合结构域的一类蛋白家族。典型的MB因子与 c-Myb有关，在动植物及一些高等真核生物的细胞周期中起调控作用。在拟南芥中至少含有100个R2R3-MYB基因，这些基因在调控植物的次级代谢，维持细胞的形状，抵御病害，响应激素等方面都起着重要的作用。先前有报道拟南芥MYB2 1和MYBM与花的发育有关，拟南芥缺失MYB21、MYB24基因后，表现为雄蕊发育受阻，花丝不能正常伸长，从而导致雄性不育。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动基因在花组织中表达的启动子。本发明提供的启动子，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用 2XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC，0. SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1所示的DNA由1670个脱氧核糖核苷酸组成。序列1所示的DNA 可以作为启动子驱动基因在植物的花组织中表达。含有所述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为将序列1所示的DNA片段插入pBI121载体的多克隆位点得到的重组质粒。本发明还保护一种在植物的花组织中表达外源基因的方法，是将DNA片段甲导入植物中，从而在植物的花组织中表达所述外源基因；所述DNA片段甲自上游至下游依次含有所述启动子和所述外源基因。可以先将所述启动子与所述外源基因连接，形成融和DNA，然后用融合DNA构建重组表达载体，导入植物。也可以将所述启动子和所述外源基因分别插入出发载体上适合的多克隆位点，得到用所述启动子驱动所述外源基因表达的重组表达载体，然后将重组表达载体导入植物。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。重组表达载体可通过使用 Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物。所述方法具体可通过将如下重组表达载体导入植物中实现分别将所述的启动子和所述外源基因插入PBI121载体的多克隆位点得到重组表达载体；所述启动子位于所述外源基因的上游。所述植物具体可为十字花科植物，如拟南芥(如Columbia-O生态型)等。本发明提供了一个启动子，该启动子可以驱动基因在植物的花组织中表达。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物特别是十字花科的蔬菜花卉的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前
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图 1 为 pBI121-MYB24pro-GUS 载体图谱图2为转基因拟南芥的花器官GUS染色情况；A-H 不同的转基因植株。图3为野生型拟南芥的花器官⑶S染色情况；A-H 不同的野生型植株。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-O生态型 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC),禾中子号CS6673。农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101 简称农杆菌菌株GV3101 参考文献:Floral dip :a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Clough SJ,Bent AF. Plant Journal. 1998 ；16 :735-43 ；公众可以从清华大学获得。实施例1、MYB24pro序列的获得以拟南芥(Columbia-O)叶片DNA为模板，采用Fl和Rl组成的引物对，在高保真的PFU酶的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fl 5' -ttaAAGCTT ttacccaattcctgag-3'；Rl :5，-tttTCTAGA gagagaaatagaaag-3，。将PCR扩增产物进行测序，如序列表的序列1所示。将序列表的序列1所示的DNA 命名为MYBM启动子(MYB24pro)。实施例2、转基因植株的获得和鉴定一、重组表达载体(pBI121-MYB24pro-GUS)的构建1、用限制性内切酶HindIII和)(baI双酶切实施例1得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。
2、用限制性内切酶 HindIII 和 XbaI 双酶切 pBI121 载体(GenBank :AF485783. 1)， 回收约141Λ的载体骨架。3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架在T4 DNA连接酶的作用下进行连接， 得到重组质粒pBI121-MYB24pro-GUS。重组质粒pBI121-MYB24pro_GUS的结构示意图见图 1。根据测序结果，对重组质粒pBI121-MYB24pro-GUS进行结构描述如下在pBI121载体的 HindIII和^CbaI酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA得到的重组质粒。二、转基因植株的获得1、将重组质粒pBI121-MYB24pro-GUS电击转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆 M (Agrobacterium tumefaciens GV3101/pBI121_MYB24pro_GUS)。2、过夜培养步骤1的重组农杆菌并调整其浓度为0D600 = 0. 8的菌液。3、通过花浸泡法(花浸在步骤2的菌液中30秒)将重组质粒 pBI121-MYB24pro-GUS分别导入64株拟南芥(Columbia-O)，收获的种子即为TO代拟南芥的种子。4、将TO代拟南芥的种子播种于含卡那霉素O0mg/L)的MS培养基上进行筛选，得到M株具有卡那霉素抗性的Tl代拟南芥(编号依次为1-24)。5、待Tl代拟南芥长至4-6片叶子时将其移栽到蛭石上生长45天；16小时 /光照+8小时/黑暗)，分别提取M株Tl代拟南芥叶子的DNA，用F2 (MYB24pro的正向引物)和R2(GUS的反向引物)组成引物对进行PCR鉴定，如果显示约1742bp的PCR扩增产物，则植株为转基因植株。F2 :5， -tta aagctt ttacccaattcctgag-3，；R2 :5， -cacgggttggggtttctacag-3，。结果表明二4株Tl代拟南芥均为转基因拟南芥。三、野生型拟南芥的培养将长至4-6片叶子的拟南芥(Columbia-Ο)移栽到蛭石上生长45天；16小时/光照+8小时/黑暗)。四、⑶S染色分析将步骤二中在蛭石上生长45天的转基因拟南芥( 株)和步骤三中在蛭石上生长45天的野生型拟南芥(20株)进行GUS染色分析。M株转基因拟南芥花器官均显示蓝色，花器官染色的部分结果见图2。20株野生型拟南芥花器官均未被染色，花器官染色的部分结果见图3。结果表明，序列1所示的启动子确实可以驱动⑶S基因在花中表达。
权利要求
1.一种启动子，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将序列1所示的DNA片段插入pBI121载体的多克隆位点得到的。
4.一种在植物的花组织中表达外源基因的方法，是将DNA片段甲导入植物中，从而在植物的花组织中表达所述外源基因；所述DNA片段甲自上游至下游依次含有权利要求1所述启动子和所述外源基因。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段甲通过重组表达载体导入所述植物；所述重组表达载体为将权利要求1所述的启动子和所述外源基因插入PBI121载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述启动子位于所述外源基因的上游。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述植物为十字花科植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述十字花科植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种驱动基因在花组织中表达的启动子。本发明提供的启动子，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明提供的启动子可以驱动外源基因在植物的花组织中表达。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物(特别是十字花科的蔬菜花卉)的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
文档编号A01H5/00GK102286484SQ20111020046
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者吴德伟, 宋素胜, 彭文, 樊萌, 谢道昕, 黄煌, 齐天从 申请人:清华大学