专利名称：提高天山雪莲中苯丙素类有效成分含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高天山雪莲中苯丙素类有效成分含量的方法。
背景技术：
天山雪莲(Saussurea involucrata)又名雪莲花，菊科风毛菊属。是民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。一般分布于海拔4，000米以上的高山流石滩上。早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。主要的活性成分有类黄酮、生物碱、内酯、留醇、多糖及挥发油等多种成分(陈发菊等.1999)。一般认为活性成分为类黄酮、雪莲多糖和生物碱，其中又以类黄酮为主。目前，市场上对山雪莲的需求日益增长，主要是需要其中的活性成分。因此需要发展人工快速繁殖天山雪莲的方法，并且提高其品质，如活性成分稳定高产。近年来，随着植物分子生物学研究的迅猛发展，植物基因工程技术日益成熟，利用重组DNA技术来对生物细胞内代谢途径进行定向改造，提高植物次生代谢物合成的成功案例比比皆是，为天山雪莲的基因工程调控，提供了切实可行的理论基础和指导意义。拟南芥PAPl基因的核苷酸序列的Genbank number是NM_104541。其中第49-795 位核苷酸是拟南芥PAPl基因。玉米Lc基因的核苷酸序列的Genbank number是NM_001111869。其中第376-2208
位核苷酸是玉米Lc基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种天山雪莲的遗传转化方法。本发明所提供的天山雪莲的遗传转化方法，包括如下步骤将天山雪莲的外植体用含有外源基因的重组农杆菌菌液侵染，再进行抗性筛选培养，得到转基因天山雪莲外植体。上述遗传转化方法中，所述侵染的方法包括如下步骤将所述外植体浸入所述菌液中，并一起置于容器中，然后将容器抽真空至所述外植体悬浮于所述菌液的液面，再向容器内通入空气至常压，所述外植体悬沉入所述菌液中，在常压下保持5 20分钟。上述遗传转化方法中，所述天山雪莲的外植体为天山雪莲的幼胚愈伤组织。上述遗传转化方法中，所述重组农杆菌的宿主菌为根癌农杆菌，具体为根癌农杆菌LBA4404或根癌农杆菌EHA105 ；上述遗传转化方法中，所述幼胚愈伤组织按照如下方法制备得到将去掉外壳和种皮的天山雪莲种子接于愈伤组织诱导培养基中，22°C 暗培养^-32d，得到所述幼胚愈伤组织；上述遗传转化方法中，所述愈伤组织诱导培养基的组成及各成分在愈伤组织诱导培养基中的浓度如下2，4-D 3 5mg/L，抑菌物质50 100mg/L，余量为NB培养基。上述遗传转化方法中，所述抑菌物质为头孢霉素。上述遗传转化方法中，所述抗性筛选培养中，抗性筛选培养基组成及各成分在抗性筛选培养基中的浓度如下2，4-D 2 ;3mg/L，6-BA 0. lmg/L 0. 3mg/L,抑菌物质100 200mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余量为MS培养基。上述遗传转化方法中，所述抑菌物质为头孢霉素。上述遗传转化方法中，所述抗性筛选标记物质及其在抗性筛选培养基中的浓度为卡那霉素80 120mg/L或潮霉素20 40mg/L。上述遗传转化方法中，所述方法中，在得到转基因天山雪莲外植体后，包括芽诱导培养步骤，其中，芽诱导培养基组成及各成分在芽诱导培养基中的浓度如下6-BA 1 2mg/L，NAA 0. 1 0. 2mg/L，抑菌物质80 120mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余
量为MS培养基。上述遗传转化方法中，所述抑菌物质为头孢霉素。上述遗传转化方法中，所述抗性筛选标记物质及其在芽诱导培养基中的浓度为卡那霉素50 80mg/L或潮霉素10 30mg/L。上述遗传转化方法中，所述方法中，在芽诱导培养步骤后，包括生根培养步骤，其中，生根培养基由MS培养基和NAA组成，NAA在生根培养基中的浓度为0. 1 0. 5mg/L。上述遗传转化方法中，所述抗性筛选培养、芽诱导培养和生根培养的条件均为每天在22-24°C下光照培养14-18h，再在21_23°C下暗培养6_10h。本发明的另一个目的是提供一种提高天山雪莲中苯丙素类物质含量的方法。本发明所提供的提高天山雪莲中苯丙素类物质含量的方法，包括如下步骤按照上述任一遗传转化方法，将拟南芥PAPl基因和玉米Lc基因共同转入出发天山雪莲中，得到苯丙素类物质含量高于所述出发天山雪莲的转基因天山雪莲。上述提高天山雪莲中苯丙素类物质含量的方法中，所述苯丙素类物质为如下中的至少一种花青素、绿原酸、紫丁香苷、芦丁、1，5_ 二咖啡酰奎宁酸、3-二咖啡酰奎宁酸、 4-二咖啡酰奎宁酸、金圣草黄素-7-0-葡萄糖苷、高车前素-7-0-葡萄糖苷、牛蒡子苷、高车前素、棕矢车前素、刺槐黄素和槲皮素-7-0-葡萄糖苷。上述提高天山雪莲中苯丙素类物质含量的方法中，所述花青素为矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷III、矢车菊素-葡萄糖苷或矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷II。上述提高天山雪莲中苯丙素类物质含量的方法中，所述基因以如下表达盒的形式导入由CaMV 35S启动子、TEV、拟南芥PAPl基因、玉米Lc基因和nos终止子依次连接构成的表达盒，艮P 35S:TEV_PAPl:Lc:nos。 TEV 表示 Tobacco Etch Virus leader。本发明的另一个目的是提供一种用于天山雪莲的遗传转化的培养基组合物。本发明所提供的用于天山雪莲的遗传转化的培养基组合物，由如下各个培养基组成，各个培养基独立包装，抗性筛选培养基组成及各成分在抗性筛选培养基中的浓度如下2，4_D 2 3mg/L，6-BA 0. 1 0. 3mg/L，抑菌物质100 200mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L, 余量为MS培养基；所述抑菌物质为头孢霉素；
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所述抗性筛选标记物质及其在抗性筛选培养基中的浓度为卡那霉素80 120mg/ L或潮霉素20 40mg/L ；芽诱导培养基组成及各成分在芽诱导培养基中的浓度如下6-BA 1 ang/L， NAA 0. 1 0. ang/L，抑菌物质80 120mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余量为MS
培养基；所述抑菌物质为头孢霉素；所述抗性筛选标记物质及其在芽诱导培养基中的浓度为卡那霉素50 80mg/L或潮霉素10 30mg/L ；生根培养基由MS培养基和NAA组成，NAA在生根培养基中的浓度为0. 1 0. 5mg/ L0本发明天山雪莲的遗传转化方法，工艺流程简单，转化效率极高，成本低，克服了现有天山雪莲遗传转化率极低等缺陷。利用本发明天山雪莲的遗传转化方法，将拟南芥 PAPl基因和玉米Lc基因共同转入天山雪莲，得到的天山雪莲中如下活性成分含量显著提高苯丙素类物质、绿原酸，1，5-二咖啡酰奎宁酸和紫丁香苷。因此，本发明方法在天山雪莲的遗传转化即品质改良领域具有广阔的应用前景。
图1为天山雪莲遗传转化过程。图2为转基因天山雪莲⑶S检测。图3为转基因天山雪莲PCR检测。 图4为转PAPl，Lc和PAPl Lc愈伤组织和植株的比较。图5为转PAPl和Lc的天山雪莲PLl细胞系PCR-Southern检测。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。质粒pCAMBIA1301，含有报告基因⑶S，为潮霉素植物选择标记。⑶S 编码β -葡萄糖苷酸酶的基因。根癌农杆菌菌种LBA4404购自Biovector Science Lab，he。根癌农杆菌EHA105 购自 Biovector Science Lab, Inc0实施例1、向天山雪莲中转入⑶S基因方法I一、遗传转化操作1、天山雪莲幼胚愈伤组织的诱导天山雪莲(S. involucrata)种子采自新疆和静县，从花序中剥得种子清洗挑选健康饱满，无霉变的种子。消毒70%乙醇浸泡30s，次氯酸钠作用30 60min，无菌水清洗4-6次。在无菌条件下，去掉外壳和种皮，将其接在愈伤组织诱导培养基上，于23°C暗培养，大约30d后，从种子胚轴和子叶边缘能够生长出颗粒状黄色愈伤组织，得到幼胚愈伤组织。
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愈伤组织诱导培养基NB+^ig/L的2，4_D+75mg/L头孢霉素。增殖培养将颗粒状黄色愈伤组织再转入愈伤增殖培养基，23°C暗培养，进行增殖培养。愈伤增殖培养基NB+2mg/L的2，4-D。2、农杆菌培养电击转化法将pCAMBIA1301导入根癌农杆菌LBA4404中，从YEB固体培养基上挑取上述重组根癌农杆菌单克隆，接种到20mL卡那霉素的YEB液体培养基中摇菌培养至对数生长晚期；再从中取0. 5mL转接至50mL YEB培养基中，同样条件下培养至 OD600 0. 5 ；4000g离心IOmin后，沉淀用等体积的培养基(NB+3mg/L的2，4_D)重悬，得到菌悬液。3、侵染将幼胚愈伤组织切成直径2mm大小，浸入菌液中，置于真空干燥器，抽真空至-23Hg，直到所有愈伤组织块浮于液面，再释放空气至常压，愈伤块沉入转化液中，在常压下侵染约15min。4、抑菌培养将侵染后的幼胚愈伤组织取出，用无菌滤纸吸干后转移到愈伤组织诱导培养基上(在培养基表面铺一张无菌滤纸)，25°C暗培养3天。5、筛选培养将愈伤组织转至新的筛选培养基上，筛选一代；两周后，筛选二代0周/代)；两周后，筛选三代0周/代)。蹄选培养基:MS+2.5mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+150mg/L 抑菌剂头孢霉素 +30mg/ L潮霉素。转化效率平均为45%。转化效率=具有抗性的愈伤组织块数/用于转化的愈伤组织块数。6、芽诱导培养取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至芽诱导培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生芽；芽诱导培养基:MS+1.52mg/L 6-BA+O. 15mg/L NAA+100mg/L 抑菌剂头孢霉素 +20mg/L潮霉素。生芽效率平均为15%。生芽效率=生芽的愈伤组织块数/用于芽诱导的愈伤组织块数。7、生根培养将再生芽切下，转至生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至IOcm左右时，打开容器封口膜，炼苗2 3天，然后将小苗移入人工气候室栽培。生根壮苗培养基MS+0. 3mg/L NAA。筛选、芽诱导培养和生根培养条件均为每天在23°C下光照培养16h，再在22°C下暗培养》1。生根效率平均为75%。生根效率=生根的愈伤组织块数/用于生根培养的愈伤组织块数。天山雪莲遗传转化过程如图1所示。a，未进行遗传转化的幼胚愈伤组织；b，筛选培养得到的抗性愈伤组织；c，筛选培养得到的抗性愈伤组织；d，诱导再生芽；e，f，再生芽；g，诱导生根；h，转基因天山雪莲移栽。二、转基因植株的PCR检测1、PCR 检测CTAB提取法提取转基因植株叶片DNA，采用GUS因设计引物进行PCR检测引物为GUS GUS-F :5’ -TGCTGTCGGCTTTAACCTCT-3’GUS-R 5' -GGCACAGCACATCAAAGAGA-3‘PCR 反应体系(25 μ L)
Taq polymerase (10 u/mL) 0. 2 μ
10 X buffer2.5 μ
dNTP (500 mM)1 μ
Primer 1 (10mM) 1 μ
Primer 2 (10mM) 1 μ
H2O18.3 μ
DNA1 μ
Total25 μ PCR反应体系程序:94°C,4min ；94°C lmin，50°C 60°C lmin，72°C 1 2min，32 循环；72°C IOmin。PCR检测结果如图3所示。M，DNA marker ； 1道，野生天山雪莲；2道，载体质粒 PCAMBIA1301 ；3_16道，转基因天山雪莲。2、⑶S活性检测50mmol/L 磷酸钠缓冲液(PBS，pH = 7. 0)。A 液=NaH2PO4 · 2H20 3. 12g 溶于 IOOmL 纯水中；B 液=Na2HPO4 · 12H20 7. 17g 溶于 IOOmL 纯水中。取 A 液 39mL, B 液 6ImL 混合定容至 400mLo25mg/g X-Gluc 储备液25mg 的 Χ-Gluc 溶于 ImL 的 N-N- 二甲基酰胺(DMF)中，低
温避光保存。500mM Na2EDTA 溶液(pH = 8. 0) 18. 6g Na2EDTA ·2Η20，溶入 80mL 纯水中，用 NaOH 调PH到8.0，定容至IOOmL0GUS 染色液2. 4mL PBS (50mM) ,40 μ L X-Gluc 储备液(25mg/g)，30 μ L Na2EDTA 溶液(500mM)，300 μ L 甲醇。取步骤5得到的愈伤组织、步骤7得到的植物叶片和步骤7得到的植株分别用GUS 染色液浸没，置于37 °C反应1 Mi。反应完全后转入75%乙醇中，75 °C脱色Mi，观察照相。结果如图2。a，抗性愈伤组织；b，诱导再生芽；C，再生芽；d，转基因天山雪莲叶片； e，转基因天山雪莲植株。三、遗传转化效率
遗传转化效率的统计结果平均5%。统计方法遗传转化效率=PCR检测阳性或 GUS染色阳性的植株数目/用于转化的愈伤组织块数目。方法II在方法I的基础上，具体做如下改变一、遗传转化操作1、天山雪莲幼胚愈伤组织的诱导愈伤组织诱导培养条件为22°C暗培养，大约观山得到幼胚愈伤组织。愈伤组织诱导培养基NB+3mg/L的2，4_D+50mg/L头孢霉素。3、侵染在常压下侵染约5min。5、筛选培养筛选培养基MS+ang/L2，4-D+O. lmg/L 6-BA+lOOmg/L 抑菌剂头孢霉素+20mg/L
潮霉素。转化效率平均为1%。转化效率=具有抗性的愈伤组织块数/用于转化的愈伤组织块数。6、芽诱导培养芽诱导培养基MS+lmg/L6-BA+O. lmg/L NAA+80mg/L 抑菌剂头孢霉素+10mg/L 潮霄素。生芽效率平均为25%。生芽效率=生芽的愈伤组织块数/用于芽诱导的愈伤组织块数。7、生根培养生根壮苗培养基MS+0. lmg/L NAA。筛选、芽诱导培养和生根培养条件均为每天在22°C下光照培养14h，再在21°C下暗培养Mi。生根效率平均为75%。生根效率=生根的愈伤组织块数/用于生根培养的愈伤组织块数。三、遗传转化效率遗传转化效率的统计结果平均为0. 15%。方法III在方法I的基础上，具体做如下改变一、遗传转化操作1、天山雪莲幼胚愈伤组织的诱导愈伤组织诱导培养条件为暗培养，大约32d，得到幼胚愈伤组织。愈伤组织诱导培养基NB+5mg/L的2，4-D+lOOmg/L头孢霉素。3、侵染在常压下侵染约20min。5、筛选培养筛选培养基MS+3mg/L2，4-D+O. 3mg/L 6_BA+200mg/L 抑菌剂头孢霉素+40mg/L
潮霉素。
转化效率平均为5%。转化效率=具有抗性的愈伤组织块数/用于转化的愈伤组织块数。6、芽诱导培养芽诱导培养基MS+2mg/L6-BA+O. 2mg/L NAA+120mg/L 抑菌剂头孢霉素+30mg/L
潮霉素。生芽效率平均为15%。生芽效率=生芽的愈伤组织块数/用于芽诱导的愈伤组织块数。7、生根培养生根壮苗培养基MS+0. 5mg/L NAA。筛选、芽诱导培养和生根培养条件均为每天在下光照培养18h，再在23°C下暗培养IOh。生根效率平均为75%。生根效率=生根的愈伤组织块数/用于生根培养的愈伤组织块数。三、遗传转化效率遗传转化效率的统计结果平均为0. 6%。实施例2、向天山雪莲中转化拟南芥PAPl一、拟南芥PAPl的cDNA克隆pRTL2 载体购自 Biovector Co.，LTD。以拟南芥野生型Col莲座叶片为原料，Trizol法提取总RNA，DNA酶(RNAse free) 除去残留DNA后定量，备用。参照反转录酶AMV说明书合成cDNA 取1 μ g植物，与Oligo dT引物以0. 5 μ g primer/ μ g总RNA的比例混合，70°C水浴5min,冰上冷却。根据PAPl的序列设计引物，保证扩增片段经内切酶)CbaI与NcoI酶切后获得其ORF序列。PAPl的ORF 以NcoI内切酶切位点中的ATG起始，因此上游引物中不需要额外引入NcoI酶切位点，设计在起始密码子上游即可，引物为PAPlF (5’ -GTCCGTACCTTTTACAATTTGTTTA-3’)，下游引物含 XbaI 酶识别位点，为 PAPlR(5，-GTTCTAGAAAGCAAACCTATACACAAAC-3‘)；以拟南芥叶片 cDNA 为模板扩增出847bp的产物，纯化后用NcoI和^CbaI酶切过夜，纯化酶切产物，然后与经过 NcoI和^CbaI酶切的pRTL2载体于16°C连接过夜，连接产物转化DH5 α ；转化后的受体菌涂于氨苄青霉素(Amp)平板上37°C培养，PCR和酶切检测克隆，最后测序验证，得到正确质粒， 将其命名为PRTL2-PAP1 (其中插入的PAPl基因为Genbank number NM_104541中第49-795 位核苷酸所示基因)。在PRTL2-PAP1中的HindIII和HindIII酶切位点间的基因片段为 35S: TEV-PAP1 :nos (TEV 表不 Tobacco Etch Virus leader)。二、植物表达载体构建pSRLC349质粒按照如下方法制备在pUC18的EcoRI位点插入35S启动子和 HindIII位点插入nos终止子，再在两者之间的EcoRI和HindIII插入了 Lc基因的cDNA序列。其中插入的Lc基因cDNA序列为Genbank number NM_001111869中第376-2208位核
苷酸所示。pCAMBIA-PAPl :Lc 的构建pSRLC;349 质粒为 EcoRI 和 HindIII 两个单一酶切位点间含有35S: :Lc(2. 2kb cDNA) :nos序列，用EcoRI和HindIII双酶切获得的片段， 插入到pCAMBIA1301载体多克隆位点中EcoRI和HindIII之间，获得Lc基因的过表达载体 pCAMBIA-Lc。再将 pRTL2_PAPl 经 HindIII 单酶切获得含有 35S:TEV_PAP1 :nos 序列，将其插入到pCAMBIA-Lc的HindIII酶切位点处，即获得PAPl和LC双价过表达载体pCAMBIA-PAAPl Lc。载体中35S、Lc、nos、TEV-PAPl的相对位置关系是 35STEV-PAPlLc:nosο三、表达载体质粒转化农杆菌挑取农杆菌EHA105单菌落于IOmL YEB液体培养基中，振荡培养至对数生长晚期；取0. 5mL菌液加入50mL新鲜YEB液体培养基中，振荡培养至OD6tltl 0. 5 ；转移至50mL离心管中，冰浴20min ；4°C,4, OOOrpm离心lOmin，收集菌体；沉淀用10%的甘油重悬，重复一次；取50 μ L感受态细胞，加入0. 1 μ g质粒，轻轻混勻；电激法转化，电激参数为2500V，50ms，电激完成后迅速加入ImL的YEB液体培养基，振荡培养Ih复苏， 10，OOOrpm离心30sec,取100 μ L的YEB重悬细胞涂平板含100mg/mL卡那霉素(Kan)和 125mg/mLRif,于暗培养2_3天；从转化后的平板挑取单菌落接种至2mL YEB液体培养基(lOOyg/mL Kan, 125 μ g/mLRif)中，28°C振荡培养过夜，进行菌落PCR鉴定。得到阳性重组菌。四、天山雪莲的遗传转化方法与实施例1中方法I中所述一致。设如下处理组转空载体pCAMBIA1301组，转pCAMBIA-PAP1 Lc组(共转化组)， 转 pCAMB IA-PAPl 组，转 pCAMB IA-Lc 组。转化过程如图4所示。a，e分别为转pCAMBIA1301抗性愈伤组织和转基因植株； b，f分别为转pCAMBIAPAPl Lc的抗性愈伤组织和转基因植株；c，g分别为转pCAMBIA-PAPl 的抗性愈伤组织和转基因植株；d，h分别为转pCAMBIA-Lc的抗性愈伤组织和转基因植株； bar = 5mm ο从表型看出，转pCAMBIAPAPl:Lc抗性愈伤组织和转基因植株产生了红色性状，而对照转pCAMBIA-PAPl和转pCAMBIA-Lc的抗性愈伤组织和转基因植株的表型没有变化，表明通过共转化PAPl和Lc基因可以诱导雪莲花青素的合成。五、转基因天山雪莲的PCR检测小量植物DNA提取法提取转基因植株叶片DNA，根据PAPl和LC基因设计引物进行 PCR检测引物为PAPlPAPl-RTF:5’ -AATTGCTGGAAGATTACCTGG--3
PAPl-RTR:5’ -CCATCGAAAAGACTCCAAAGT--3
LcLc-RTF 5'‘-ATGGCGCTTTCAGCTTCCCGA-3‘
Lc-RTR 5'‘-TGTACCAAGCTCAAGCACGCC-3 ‘
PCR反应体系(25 μ L)
Taq polymerase(10 u/mL)0.2 μ
10 X buffer2.5 μ
dNTP (500 mM)1 μ
Primer 1 (10 mM)1 μ
Primer2 (10 mM) 1 μ
H2O18.3 μ
DNA1 μ
Total25 μ PCR反应体系程序:94°C,4min ；94°C lmin，50°C 60°C lmin，72°C 1 2min，32 循环；72°C IOmin。结果如图5所示。1，野生型天山雪莲对照；2，pCAMBIA-PAPl:Lc质粒，3-9，转 pCAMBIA-PAPl:Lc的天山雪莲植株叶片。转化效率平均为4. 5%。转化效率=PCR鉴定阳性的植株数目/用于转化的愈伤组织块数目。六、天山雪莲中苯丙素类物质的提取及定量检测取新鲜且生长健壮的转基因植株，称量其鲜重(FW)；用液氮将植株碾磨成粉末， 转入预冷的离心管中，置于_40°C下真空干燥，24h后称量获得对应的材料的干重(DW)，根据鲜重和干重可以得出材料中的含水量。称取0. 02g左右的粉末加入lmL70%的甲醇水溶液，在4°C下浸提24h后，离心，取上清，过0. 2 μ m孔径尼龙滤膜备用。采用HPLC相对定量法对样品中花青素，绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎宁酸定量。检测波长515. Onm;矢车菊素-3芸香糖(Cy3Rut)为参照品，所测得的花青素含量均为相对Cy3Rut的含量。根据在^Onm下峰面积绘制绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎宁酸的标准曲线回归方程，用于计算其在样品中的绝对含量。各种组分含量以mg/g干燥样品(DW)计。色谱柱为0DS-80TsQA C18column,柱长250mm，柱径4. 6mm，填充介质为C18，孔径 5μπι;柱温 35°C ；自动进样器进样，进样量10μ 1 ；梯度洗脱液为流动相的组成为Α相=甲酸水(0.2 99.8，ν/ν) ；B相=乙腈；流速为 0. 8ml/min ；洗脱方式:0min, 7% B ；30min, 19% B ；40min,25% B ；60min,27% B ； 70min,35% B ；80min,40% B ；and 90min,7% B。花青素矢车菊素-3芸香糖标准品购自Sigma，产品目录号为36428。绿原酸标准品购自上海同田生物技术有限公司，产品目录号为E-0075。紫丁香苷标准品购自上海同田生物技术有限公司，产品目录号为E-0238。芦丁标准品购自上海同田生物技术有限公司，产品目录号为E-0124。1，5-二咖啡酰奎宁酸标准品购自上海同田生物技术有限公司，产品目录号为E-0453。矢车菊素-3芸香糖标准品的保留时间为8. 6min。样品中矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷III的保留时间为27. 6min。矢车菊素-葡萄糖苷的保留时间为10. 5min。矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷II的保留时间为22. 58min。绿原酸标准品的保留时间为5. 5min。紫丁香苷标准品的保留时间为7. !Bmin。1， 5-二咖啡酰奎宁酸标准品的保留时间为^min。芦丁标准品的保留时间为25min。采用高效液相-质谱联用法，检测到其它苯丙素类物质。
(1)花青素含量结果如下矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷II和矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷III是矢车菊素-葡萄糖苷的两种异构体。矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷III 转基因植株，2.621mg/gDW;对照天山雪莲，Omg/ gDffo矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷II 转基因植株，0.061mg/gDW;对照天山雪莲，Omg/ gDffo矢车菊素-葡萄糖苷转基因植株，0. 114mg/gDff ；对照天山雪莲，Omg/gDW。以上结果说明通过转基因使愈伤组织合成花青素，含量最高的花青素为矢车菊素-丙二酰葡萄糖苷III。(2)绿原酸，紫丁香苷、芦丁和1，5_ 二咖啡酰奎宁酸含量绿原酸转基因植株，2. 079mg/g Dff ；对照天山雪莲，0. 37mg/g Dff01,5- 二咖啡酰奎宁酸转基因植株6. 869mg/g Dff ；对照天山雪莲0. 79mg/g Dff0紫丁香苷转基因植株，9. 86mg/g Dff ；对照天山雪莲5. 8mg/g DW。芦丁 转基因植株，0. 23mg/g Dff ；对照天山雪莲0. 048mg/g DW。以上结果说明通过转基因愈伤组织中绿原酸、芦丁、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎宁酸含量提高。(3)其它苯丙素类物质(均为相当于绿原酸含量)3-二咖啡酰奎宁酸转基因植株，0. 0056mg/g Dff ；对照天山雪莲，0. 0017mg/g Dff04- 二咖啡酰奎宁酸转基因植株，0. 028mg/g Dff ；对照天山雪莲，0. 0132mg/g Dff0以上结果说明通过转基因愈伤组织中3-二咖啡酰奎宁酸和4-二咖啡酰奎宁酸含
量提高。(4)其它7种苯丙素类物质(均为相当于芦丁含量)金圣草黄素-7-0-葡萄糖苷转基因植株，0.0115mg/g DW ；对照天山雪莲，Omg/ gDffo高车前素-7-0-葡萄糖苷转基因植株，0. 0023mg/g Dff ；对照天山雪莲，Omg/gDW。牛蒡子苷转基因植株，0. 0020mg/g Dff ；对照天山雪莲，0mg/g Dff0高车前素转基因植株，0. 0122mg/g Dff ；对照天山雪莲，0mg/g DW。棕矢车前素转基因植株，0. 0058mg/g Dff ；对照天山雪莲，0mg/g DW。刺槐黄素转基因植株，6. 8E-4mg/g Dff ；对照天山雪莲，0mg/g DW。槲皮素-7-0-葡萄糖苷转基因植株，0. 0060mg/g Dff ；对照天山雪莲，0mg/g DW。通过质谱在转基因植株中检测到如上7种成分，而在非转基因天山雪莲中未检测到。结果显示，转基因株系中绿原酸、紫丁香苷、1，5_ 二咖啡酰奎宁酸、芦丁、3-咖啡酰奎宁酸和4-咖啡酰奎宁酸含量平均提高了 4.8、1.7、3. 5、5.0、3. 5和2. 1倍左右。此外， 还检测到其它7种成分金圣草黄素7-0-葡萄糖苷、高车前素7-0-葡萄糖苷、牛蒡子苷、高车前素、棕矢车菊素、刺槐黄素和槲皮素3-0-葡萄糖苷，它们在对照中未检测到。以上各种结果均为平均值。
权利要求
1.天山雪莲的遗传转化方法，包括如下步骤将天山雪莲的外植体用含有外源基因的重组农杆菌菌液侵染，再进行抗性筛选培养，得到转基因天山雪莲外植体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述侵染的方法包括如下步骤将所述外植体浸入所述菌液中，并一起置于容器中，然后将容器抽真空至所述外植体悬浮于所述菌液的液面，再向容器内通入空气至常压，所述外植体悬沉入所述菌液中，在常压下保持5 20分钟。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述天山雪莲的外植体为天山雪莲的幼胚愈伤组织。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述重组农杆菌的宿主菌为根癌农杆菌；所述幼胚愈伤组织按照如下方法制备得到将去掉外壳和种皮的天山雪莲种子接于愈伤组织诱导培养基中，22°C 暗培养^-32d，得到所述幼胚愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基的组成及各成分在愈伤组织诱导培养基中的浓度如下2， 4-D 3 5mg/L，抑菌物质50 100mg/L，余量为NB培养基。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述抗性筛选培养中，抗性筛选培养基组成及各成分在抗性筛选培养基中的浓度如下2，4-D 2 ;3mg/L，6-BA 0. lmg/L 0. :3mg/L，抑菌物质100 200mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余量为MS培养基。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在得到转基因天山雪莲外植体后，包括芽诱导培养步骤，其中，芽诱导培养基组成及各成分在芽诱导培养基中的浓度如下:6-BA 1 2mg/L，NAA 0. 1 0. 2mg/L，抑菌物质80 120mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余量为MS培养基。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在芽诱导培养步骤后，包括生根培养步骤，其中，生根培养基由MS培养基和NAA组成，NAA在生根培养基中的浓度为0. 1 0. 5mg/L。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述抗性筛选培养、芽诱导培养和生根培养的条件均为每天在22-24°C下光照培养14-1他，再在21-23°C下暗培养6_10h。
9.一种提高天山雪莲中苯丙素类物质含量的方法，包括如下步骤按照权利要求1-8 中任一所述方法，将拟南芥PAPl基因和玉米Lc基因共同转入出发天山雪莲中，得到苯丙素类物质含量高于所述出发天山雪莲的转基因天山雪莲。
10.一种用于天山雪莲的遗传转化的培养基组合物，由如下各个培养基组成，各个培养基独立包装，抗性筛选培养基组成及各成分在抗性筛选培养基中的浓度如下2，4-D 2 ;3mg/L， 6-BA 0. 1 0. 3mg/L，抑菌物质100 200mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余量为MS培养基；芽诱导培养基组成及各成分在芽诱导培养基中的浓度如下6-BA 1 ang/L，NAA 0. 1 0. ang/L，抑菌物质80 120mg/L，抗性筛选标记物质20 120mg/L，余量为MS培养基；生根培养基由MS培养基和NAA组成，NAA在生根培养基中的浓度为0. 1 0. 5mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种提高天山雪莲中苯丙素类有效成分含量的方法。本发明的天山雪莲的遗传转化方法，包括如下步骤将天山雪莲的外植体用含有外源基因的重组农杆菌菌液侵染，再进行抗性筛选培养，得到转基因天山雪莲外植体。本发明天山雪莲的遗传转化方法，工艺流程简单，转化效率极高，成本低，克服了现有天山雪莲遗传转化率极低等缺陷。利用本发明天山雪莲的遗传转化方法，将拟南芥PAP1基因和玉米Lc基因共同转入天山雪莲，得到的天山雪莲中如下活性成分含量显著提高苯丙素类物质、绿原酸，1，5-二咖啡酰奎宁酸和紫丁香苷。因此，本发明方法在天山雪莲的遗传转化即品质改良领域具有广阔的应用前景。
文档编号A01H5/00GK102358907SQ201110301408
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者仇键, 华学军, 赵德修 申请人:中国科学院植物研究所