专利名称：一种凝结芽孢杆菌及其发酵液和发酵方法及发酵液作为生物农药的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物农药领域，尤其是一种凝结芽孢杆菌及其发酵液和发酵方法及发酵液作为生物农药的应用。
背景技术：
凝结芽孢杆菌TQ33，呈杆状、两端钝圆、革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性、芽孢端生、无鞭毛，其在代谢过程中还会产生抗真菌活性物质，可以抑制植物病原菌的生长。凝结芽孢杆菌是目前国际市场上研究和应用的新一代益生菌，它除具有普通乳酸菌的营养保健作用外，同时还具有抗逆性强、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性成为当今研究和应用的热点，它可以对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用，是一株应用前景非常广阔的益生菌。苯乳酸是乳酸菌产生的一种新型抑菌物质，它不仅能够抑制多种食源性致病菌，而且对引起食品腐败的真菌具有广泛的作用，苯乳酸能有效抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生长。苯乳酸对真菌的最小抑菌浓度较大，主要集中在(5 10)mg/mL范围内，对红酵母、克鲁维酵母和青霉抑制作用较强，其最小抑菌浓度为5mg/mL，对毛霉的抑菌作用较弱，最小抑菌浓度为10mg/mL。此外，苯乳酸稳定性高，安全无毒，被认为是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质，已成为乳酸菌抑菌能力的有效标志之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝结芽孢杆菌及其发酵液和发酵方法及发酵液作为生物农药的应用，本发明从凝结芽孢杆菌发酵液中分离出一种抗菌活性物质，其结构鉴定为苯乳酸，验证了苯乳酸对植物病原菌的抑制作用，为凝结芽孢杆菌应用于生物农药，抑制植物病原菌生长等方面提供了实验依据。本发明实现目的的技术方案如下一种凝结芽孢杆菌，其特征在于名称为TQ33，分类名称Bacillus coagulans，保藏编号为=CGMCC No. 5233，保藏日期2011年9月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。—种凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法，其特征在于方法所用发酵培养基为g/L 蛋白胨10. 0、淀粉10. 0、溶剂为水，pH7. 2-7. 4 ；发酵条件为35-39°C摇瓶150_170r/min培养15-25小时，按照发酵条件发酵后获得发酵液。而且，所述发酵液中含有苯乳酸。而且，所述发酵液的纯化方法为(1)采用离心浓缩菌体发酵剂，浓缩条件为离心转速6000r/min，离心20min，离心温度为4°C，去除菌体，获得浓缩液；(2)离心后，弃去沉淀，将上清液在旋转蒸发仪减压蒸馏，浓缩发酵液。
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一种凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法获得的发酵液。而且，含有苯乳酸。凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法获得的发酵液的发酵液作为生物农药的应用。本发明的优点和积极效果是1、本发明从凝结芽孢杆菌TQ33发酵液中分离出一种抑制植物病原真菌的活性物质，其结构鉴定为苯乳酸，并且温室盆栽实验进一步验证了苯乳酸对植物病原菌的抑制作用，这是首次从凝结芽孢杆菌中分离出苯乳酸这种抑制植物病原菌活性物质，为凝结芽孢杆菌应用于生物农药，抑制植物病原菌生长等方面提供了实验依据。2、本发明首次从凝结芽孢杆菌中分离纯化的苯乳酸，凝结芽孢杆菌不仅具有普通乳酸菌的营养保健作用，还具有抗逆性强、耐高温高压、易于培养、发酵成本低等独特优势，因此利用凝结芽孢杆菌培养获得含有苯乳酸的发酵产物应用于生物农药更易于工业化生产。
图1为本发明液相色谱图；图2为本发明质谱图；图3为本发明核磁共振图；图4A-图4B为本发明盆栽试验图，其中图4A为用含有12mg/ml苯乳酸的发酵液喷施接种有甜瓜疫霉病原菌的西红柿苗，一周后实验结果；图4B为不加苯乳酸的液体培养基喷施接种有甜瓜疫霉病原菌的西红柿苗，一周后的实验结果；图5A-图5D为本发明苯乳酸最小抑制浓度图，其中图5A为含有18mg/ml苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉；图5B为含有Hmg/ml苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉；图5C为含有12mg/ml苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉；图5D为不含有苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一种凝结芽孢杆菌TQ33，分类名称Bacillus coagulans，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心1、种子及发酵培养基液态种子及发酵培养基(g/L)蛋白胨10.0，淀粉10.0，溶剂为水，pH7. 2-7. 4，37°C摇瓶160r/min培养20小时。2、菌体的种子制备将甘油管冻藏的菌种接到装有液体种子培养基的摇瓶中，37°C摇瓶培养20小时。3、菌体的液态深层发酵培养将培养至对数期中期的液体种子以5%的接种量接到装液量为IOOmL的250mL平底烧瓶中，于37士 1°C摇瓶培养20小时。
4、菌体的高密度放大培养(1)50L种子罐培养以8%的接种量将凝结芽孢杆菌接种于起始装液量为30L的种子罐中，发酵温度为37°C，起始搅拌转速360r/min，通风量为1 0. 5，罐压为0. 06MPa。(2) 200L发酵罐培养以8%的接种量将凝结芽孢杆菌接种于200L罐进行发酵培养，装液量70%，发酵温度为37°C，起始搅拌转速250r/min，通风量为1 0.3。5、离心分离采用离心法浓缩分离菌体，分离条件为6000r/min离心20min。6、液液萃取离心后，弃去沉淀，将上清液在旋转蒸发仪减压蒸馏，浓缩发酵液。将浓缩后的发酵液与筛选出的有机溶剂(石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，震荡15min后静置15min，然后取水相，每个重复萃取3次)进行萃取。7、薄层层析在硅胶板上用微量毛细管吸取部分标准品溶液和上述萃取后的样品溶液点于距玻璃板下边缘Icm的位置。点样斑点的直径为3 5mm，点与点之间的距离为1. 0cm，溶剂挥发干后即可用于层析。8、高压液相色谱用薄板层析法选择合适的展开剂，对活性物质进行进一步分析，同时用经典的硅胶柱柱层析法(将用上述有机溶剂萃取后的产物粗品进行硅胶柱分析，采用石油醚-甲醇梯度洗脱，洗脱过程中各组分的分离效果用薄层层析检测。确定展开剂为石油醚甲醇=9:1。)分离收集不同的组分。将上步所收集的活性物质冻干，用乙腈溶解，用高效液相色谱对硅胶柱层析馏分进行检测，检测条件所用色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq Cw色谱柱5 μ m，4. 6X 150mm，流动相为3% -100%乙腈，进行梯度洗脱，流速为lml/min，检测波长为220nm。9、抗菌物质分子量的测定检测柱为AcquityUPLC BEH C18 1. 7ym 2. IX50mm, ESI-Full scan 100-1800Da，流动相A :0. 1% FA H2O, B :CH3CN。10、核磁共振测定将目标物溶于氘代试剂中，用AV400/600核磁共振仪分别测定H-NMR、C-NMR，确定物质结构。11、温室盆栽试验液相检测浓缩发酵液中苯乳酸含量为12mg/ml，并将苯乳酸用相应的液体培养基稀释成浓度为10mg/ml，作盆栽试验，检测苯乳酸对植物病原菌的影响，以不加苯乳酸的液体培养基作对照。12、苯乳酸最小抑菌浓度(MIC)的测定将苯乳酸用相应的PDA培养基稀释成浓度为18mg/mL、Hmg/mL、12mg/mL、5mg/mL的溶液备用。以不加苯乳酸的PDA培养基作为阴性对照，在每个培养基平板上接种甜瓜疫霉菌块，每个浓度做三次重复。阴性对照平板长满疫霉时，抑制甜瓜疫霉出现明显增长的最低苯乳酸浓度即最小抑菌浓度(MIC)。结果一、分别用几种不同的有机溶剂萃取凝结芽孢杆菌的发酵液，然后分别将有机相在旋转蒸发仪上蒸干。将萃取得到的物质称量后，加去离子水悬浮，配成相同浓度，然后使用抑制菌丝甚至速率法测抑菌活性。结果如表1。通过有机溶剂萃取实验发现，使用乙酸乙酯萃取后，抑菌物质可以从水相转至有机相。二、HPLC 分析通过高压液相色谱分析，如图1所示，得到了三个含量较高的组分(分别在
1.565min，5. 590min, 16. 154min)其中第二个峰的抑菌活性最高，可以作进一步分析。三、LC-MS质谱图质谱图显示上述第二个峰，即保留时间为5. 590这个峰代表的化合物的分子量是165(图幻，化合物的分子量按正离子图谱峰值处减1计算。然后查阅文献得知苯乳酸的分子量为165，因此可以推测，该化合物有可能为苯乳酸。四、核磁共振图核磁共振图谱显示，碳谱(图3A)，氢谱(图3B)分别为13C-NMR (400MHz, DMS0_d6) δ 175. 57 (C-I) ,71. 53 (C-2)，40. 21 (C-3)，138. 60(C-4)，128. 42(C_5and C-9)，129. 85(C_6and C_8)，126. 56(C_7)；1H-NMR (400MHz, DMS0_d6) δ 7. 23(H_5and H_9)，7. 21 (H_6to H_8)，4. 17(H_2)，
2.99 (H-3a)，2. 78 (H_3b)；五、盆栽试验4A为用含有12mg/ml苯乳酸的发酵液喷施接种有甜瓜疫霉病原菌的西红柿苗，一周后实验结果。图4B为不加苯乳酸的液体培养基喷施接种有甜瓜疫霉病原菌的西红柿苗，一周后的实验结果。六、苯乳酸最小抑制浓度5A为含有18mg/ml苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉；图5B为含有Hmg/ml苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉；图5C为含有12mg/ml苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉；图5D为不含有苯乳酸的培养基培养的甜瓜疫霉。结论通过对凝结芽孢杆菌抗植物病害真菌物质分离方法的研究，根据HPLC及质谱分析，核磁共振得到其中一种抗真菌物质分子量为165，结构鉴定为苯乳酸。在测得发酵液中苯乳酸含量是12mg/ml的基础上，盆栽实验进一步证明了苯乳酸对甜瓜疫霉病原菌有抑制作用，而且最小抑制浓度实验结果显示苯乳酸对甜瓜疫霉的最小抑制浓度为12mg/ml，所以本发明的研究为凝结芽孢杆菌应用于生物农药，抑制植物病原菌生长等方面提供了实验依据。表1萃取相和萃余相对抑菌活性的影响
权利要求
1.一种凝结芽孢杆菌，其特征在于名称为TQ33，分类名称凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans，保藏编号为=CGMCC No. 5233，保藏日期:2011年9月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种由权利要求1所述的凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法，其特征在于方法所用发酵培养基为g/L 蛋白胨10. 0、淀粉10. 0、溶剂为水，pH7. 2-7. 4 ；发酵条件为35-39°C摇瓶150-170r/min培养15-25小时，按照发酵条件发酵后获得发酵液。
3.根据权利要求2所述由凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法，其特征在于所述发酵液中含有苯乳酸。
4.根据权利要求2所述由凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法，其特征在于所述发酵液的纯化方法为(1)采用离心浓缩菌体发酵剂，浓缩条件为离心转速6000r/min，离心20min，离心温度为4°C，去除菌体，获得浓缩液；(2)离心后，弃去沉淀，将上清液在旋转蒸发仪减压蒸馏，浓缩发酵液。
5.一种由权利要求2所述的凝结芽孢杆菌发酵获得发酵液的方法获得的发酵液。
6.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌发酵的发酵液，其特征在于含有苯乳酸。
7.权利要求5所述的发酵液作为生物农药的应用。
全文摘要
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌及该菌发酵获得的发酵液作为农药的应用，名称为TQ33，分类名称Bacillus coagulans，保藏编号为CGMCC No.5233，方法所用发酵培养基为g/L蛋白胨10.0、淀粉10.0、溶剂为水，pH7.2-7.4；发酵条件为35-39℃摇瓶150-170r/min培养15-25小时，按照发酵条件发酵后获得发酵液。本发明从凝结芽孢杆菌TQ33发酵液中分离出一种抑制植物病原真菌的活性物质，其结构鉴定为苯乳酸，并且温室盆栽实验进一步验证了苯乳酸对植物病原菌的抑制作用，这是首次从凝结芽孢杆菌中分离出苯乳酸这种抑制植物病原菌活性物质，为凝结芽孢杆菌应用于生物农药，抑制植物病原菌生长等方面提供了实验依据。
文档编号A01N63/02GK102382783SQ20111031393
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者戚薇, 戴玉杰, 王海宽, 肖瑞峰 申请人:天津科技大学