专利名称：高效抑制myostatin基因表达的shRNA片段及构建转基因绵羊的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效抑制myostatin基因表达的shRNA片段以及利用RNA干扰技术构建肌肉生长抑制素基因沉默的转基因绵羊的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
提高动物产肉率和瘦肉率一直是动物遗传育种学家、动物繁殖学家和动物营养学家追求的目标。通过改善饲料营养比例和使用添加剂等技术手段可以有限地提高动物产肉率和瘦肉率，但效果不显著，而且还存在一些食品安全问题。因此，探寻一条安全有效的提高动物产肉性能的途径对畜牧业的发展具有重要意义。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，属于生长分化因子β超家族成员，是肌肉生长分化的主要负调控因子。肌肉生长抑制素基因敲除小鼠的肌肉发生了广泛的增生和肥大，小鼠的骨骼肌重量增加2-3倍。但其他表型同野生型无显著差异。世界著名的具有“双肌”表型的比利时兰牛和皮埃蒙特牛都是因为该基因发生自然突变所致，它们的产肉量比野生牛要高出30%左右。同时，“双肌”牛具有肌肉群异常发达，皮下脂肪少，且有更多的脂肪沉积于肌纤维中等表型特征。这些研究表明利用基因工程方法阻断myostatin基因功能，是一种提高动物产肉量和改善肉品质的新途径。RNA干扰技术是一种在转录水平抑制基因表达的新技术，通过表达可与靶基因配对的siRNA，可实现靶基因的沉默。目前，RNA干扰沉默基因表达在各种物种的不同基因上得到了充分证明，并实现应用。
发明内容
本发明的目的在于设计、筛选出一段高效抑制myostatin基因的shRNA片段。该片段命名为shMSTN3，shMSTN3可显著抑制myostatin在细胞中的表达。本发明的另一目的在于提供一种利用RNA干扰技术构建肌肉生长抑制素基因沉默的转基因绵羊的方法。将构建的shMSTN3的表达载体转染绵羊成纤维细胞，用细胞筛选技术筛选出myostatin基因敲低的绵羊成纤维细胞，并利用体细胞核移植和胚胎移植技术制备myostatin基因沉默的转基因绵羊。上述利用RNA干扰技术构建肌肉生长抑制素基因沉默的转基因绵羊方法，是通过以下技术方案实现的(1)抑制myostatin基因表达的shRNA片段的筛选设计了 3条靶向myostatin基因的shRNA片段，将这3条shRNA片段转染细胞后，用荧光定量PCR对细胞中myostatin的表达进行检测，结果显示shMSTN3可显著抑制myostatin在细胞中的表达。(2)绵羊shRNA特异表达载体的构建使用融合PCR的方法，获得启动子TO和shMSTN3的融合表达盒子(TO_shMSTN3)，将该表达盒子克隆到PMD18-T中，产生pU6-shMSTN3载体。(3)myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞的构建将pTO_shMSTN3转染绵羊成纤维细胞，用新霉素筛选转染后的细胞，筛选7_10天后，将形成的抗性细胞克隆扩大培养。利用新霉素基因引物对细胞克隆进行PCR鉴定，从而获得myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞。(4)myostatin基因沉默转基因绵羊的构建利用体细胞核移植技术将(3)中获得细胞构建为重构胚胎，再通过胚胎移植技术将胚胎移植到代孕母羊中，对出生的羔羊进行PCR鉴定，证实成功构建myostatin基因沉默的转基因绵羊。本发明涉及利用RNA干扰技术沉默绵羊myostatin基因在体细胞中的表达。在利用体细胞核移植技术，构建一种myostatin基因沉默转基因绵羊，该转基因绵羊具有瘦肉率高，生长快速的特点。本发明利用RNA干扰技术和体细胞克隆技术构建myostatin基因敲低的转基因克隆绵羊，探索制备具有“双肌”性状的绵羊，为最终培育产肉率、瘦肉率和肉品质好的优良品种家畜奠定基础。
图 lpU6_shMSTN3 载体图谱；图2整合有shMSTN3的绵羊成纤维细胞的PCR鉴定；图3转基因绵羊的PCR鉴定。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1高效抑制myostatin基因表达的shRNA片段的筛选1. 1靶向myostatin基因shRNA片段的设计和合成应用生物信息软件设计3条靶向myostatin基因的siRNA，将siRNA序列加上loop 及终止序列，转换为 shRNA，分别为 shMSTNl、shMSTN2、shMSTN3，将 shMSTNl、shMSTN2，shMSTN3亚克隆至pGenesil-1 (晶赛公司)载体，获得pGenesil-shRNA表达载体。1. 2shRNA转染绵羊成纤维细胞转染前一天在12孔板中以DMEM(10% FBS)培养绵羊成纤维细胞，待细胞生长到80-90%丰度时，用脂质体2000，以1. 8ug/孔的shRNA表达载体转染绵羊成纤维细胞。转染后48小时，提取转染细胞及对照细胞的总RNA，-80°C保存。1. 3荧光定量PCR检测myostatin的表达荧光定量PCR检测转染shRNA的细胞及对照细胞(未转染细胞)中myostatin基因表达情况。用随机引物和反转录试剂盒对反转录细胞的总RNA，获得的eDNA用核酸定量仪定量后用于荧光定量PCR。扩增myostatin基因使用MSTN_F(5’ -ATCCGATCTCTGAAACTTGACAT-3，)和 MSTN-R(5，-AGTCCTTCTTCTCCTGGTTCTG-3，)引物。内参基因 GAPDH 使用 GAPDH-F (5，-GGCGCCAAGAGGGTCAT-3，)和 GAPDH-R (5，-GTGGTTCACGCCCATCACA-3，)引物。定量 PCR 使用了 STOR Green 染料，反应体系为 95°C/5min 后；95°C/15s，56°C/15s，720C /IOs共30个循环；myostatin的Ct值被GAPDH均一化。myostatin相对表达水平通过Δ ACT数值法定量。结果显示，shMSTNl, shMSTN2和shMSTN3分别抑制81%、56%和90%的myostatin转录水平的表达。其中shMSTN3抑制效率最高，与对照组myostatin基因表达相比具有显著差异。实施例2绵羊shRNA特异表达载体的构建2. IshRNA表达载体的构建参见图1，使用融合PCR技术，将TO启动子和shMSTN3片段实现融合。PCR反应条件为95°C /5min 后；95°C /30s, 58°C /30s, 72°C /lmin 共 30 个循环，72°C 7min.将 PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定。用凝胶回收试剂盒回收U6-shMSTN3基因片段。将回收产物亚克隆至pMD18-T载体中，产生pTO-shMSTN3载体。实施例3my0Statin基因沉默绵羊成纤维细胞的构建3. 1绵羊成纤维细胞的制备采集受精35-45d时的绵羊胚胎，，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS液洗涤3_4次后，去除头、尾、四肢和内脏部分，剩余部分放入IOmm平皿中，剪成Imm3的组织碎块，与培养箱中放置4小时后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液于C02培养箱内39. 55% C02饱和湿度培养，培养24h后根据细胞生长情况进行细胞的传代培养或冻存。3. 2绵羊成纤维细胞的转染及筛选转染前ld，将绵羊胎儿成纤维细胞以5 X 105/mL的密度加入含10%小牛血清的DMEM(无抗生素)培养基中，接种于6孔板。待细胞80% 90%融合时，将培养基换为无双抗、无血清的DMEM培养基，用pTO-shMSTN3载体转染绵羊胎儿成纤维细胞。转染3 后，1孔传4-6孔的比例稀释传代，24小时以500 μ g/mL G418筛选。筛选3_5天后，部分细胞会开始脱落死亡。10天后开始出现细胞克隆，将细胞扩大培养后，冻存备用。3. 3阳性细胞的PCR鉴定以新霉素neo基因序列设计引物，用于检测绵羊成纤维细胞克隆。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列为neo-Pl (ATTCGGCTATGACTGGGCACAAC)和neo-P2 (ACACCCAGCCGGCCACAGT)。以此为引物，以阳性细胞裂解物为模板，进行PCR扩增，反应条件为95°C 5min，95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 2min40sec，循环 36 次，72°C 10min，PCR产物长度为5^bp。能够PCR扩增出585bp外源基因片段的细胞克隆被认定为转基因阳性细胞，同时以水作PCR模板为对照。参见图2，结果共获得4株整合有外源基因的转基因细胞克隆。实施例4my0Statin基因沉默转基因绵羊的构建4. 1卵母细胞成熟培养屠宰场大量收集绵羊卵巢，运回实验室后，经生理盐水洗涤、除结缔组织等附着物后，采用切剖法从2-5mm的卵泡中，分离形态完整，细胞质致密，色泽均一，卵丘细胞在3层或3层以上的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。在38. 5°C，5% C02，饱和湿度下培养，采用微滴培养系统在卵母细胞成熟液OM中体外成熟培养22-24h。4. 2 核移植用0. 透明质酸酶吹打消化去除颗粒细胞，选择排出第一极体的卵母细胞在细胞松弛素中进行去核，将供体细胞(绵羊成纤维细胞)注入至去核卵母细胞的透明带下。
4. 3电融合将供体细胞和去核卵母细胞的接触面与电流方向放垂直。电融合的电激参数为120v/mm，3次直流电脉冲诱导体细胞与去核卵母细胞相融合。4. 4胚胎激活及培养用Ionomycin联合6-DMAP激活重构胚胎，转移到SOFaa培养液中培养，每4 半量换液1次，4 后检查卵裂率，第7d检查记录囊胚发育情况。4. 5胚胎移植选择发育形态好的2-8细胞期转基因克隆胚胎，通过外科手术移植到自然发情第3天受体绵羊两侧近输卵管伞的第一弯曲部。同样方法将桑甚胚和囊胚移植到自然发情6d，7d, 8d受体绵羊子宫角。受体绵羊手术后观察其返情情况，对未返情的绵羊在手术移植后的30-45d，用B超进行直肠孕检，以鉴定受体羊妊娠情况。实施例5my0Statin基因沉默转基因绵羊的鉴定分析5. 1转基因绵羊PCR鉴定用天根DNA基因组试剂盒提取绵羊基因组，以新霉素neo基因序列引物neo-Pl (ATTCGGCTATGACTGGGCACAAC)和 neo_P2 (ACACCCAGCCGGCCACAGT)进行 PCR 扩增，反应条件为95°C 5min，95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 2min40sec，循环 36 次，72°C 10min，PCR产物长度为5^bp。能够PCR扩增出585bp外源基因片段的绵羊被认定为转基因克隆绵羊，同时以非转基因绵羊基因组DNA和水为PCR模板为对照。参见图3，结果获得2只转基因克隆绵羊。5. 2转基因绵羊myostatin的表达分析提取绵羊肌肉组织总RNA，用随机引物和反转录试剂盒进行反转录，获得的cDNA用核酸定量仪定量后用于荧光定量PCR。扩增myostatin基因使用MSTN-F (5，-ATCCGATCTCTGAAACTTGACAT-3，)禾口 MSTN-R(5，-AGTCCTTCTTCTCCTGGTTCTG-3，)引物。内参基因 GAPDH使用 GAPDH-F (5，-GGCGCCAAGAGGGTCAT-3，)和 GAPDH-R (5，-GTGGTTCACGCCCATCACA-3，)引物。定量 PCR 使用了 STOR Green 染料，反应体系为 95°C/5min 后；95°C/15s，56°C/15s，72°C /10s共30个循环；myostatin的Ct值被GAPDH均一化。myostatin相对表达水平通过Δ Δ CT数值法定量。结果显示，2只转基因克隆绵羊中myostatin基因表达量分别降低7 71%和 49%。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.高效抑制myostatin基因表达的ShRNA片段shMSTN3，其核苷酸序列为5’_CAAAGATGCTATAAGACAATTCAAGAGATTGTCTTATAGCATCTTTGTTTTTTGGMCG-3’3’-GTTTCTACGATATTCTGTTAAGTTCTCTAACAGAATATCGTAGAAACAAAAAACCTTGC-5’。
2.一种利用RNA干扰技术构建肌肉生长抑制素基因沉默的转基因绵羊的方法，其特征在于，包括以下主要步骤(1)根据绵羊myostatin基因的序列，鉴定出一条可高效抑制myostatin基因表达的shRNA 片段shMSTN3 ；(2)构建了靶向myostatin基因的shRNA表达载体；(3)转染绵羊成纤维细胞，获得整合有shRNA表达载体的绵羊成纤维细胞；(4)体细胞核移植和胚胎移植获得整合有shRNA表达载体的转基因绵羊；(5)利用PCR，荧光定量RT-PCR证实转基因绵羊的肌肉生长抑制素基因表达量显著下降。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在所述步骤(1)中，所述可高效抑制myostatin基因表达的shRNA片段shMSTN3，其位于myostatin基因的219_237bp位置，靴位点长度为19bp。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在所述步骤O)中，克隆TO启动子，以该启动子构建shRNA表达载体，实现靶向myostatin基因的shRNA特异表达。
全文摘要
本发明公开了一种高效抑制myostatin基因表达的shRNA片段及构建转基因绵羊的方法。本发明以靶向绵羊肌肉生长抑制素myostatin基因的shRNA构建shRNA表达载体，转染绵羊成纤维细胞后，经抗性筛选获得整合有上述shRNA表达载体的绵羊成纤维细胞，利用体细胞克隆技术及胚胎移植技术获得转基因绵羊，试验证实这种转基因绵羊的肌肉生长抑制素基因表达被沉默，表达量显著下降。
文档编号A01K67/027GK102382827SQ201110313899
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者乔军, 倪伟, 哈孜, 张辉, 王远志, 王鹏雁, 盛金良, 胡圣伟, 赛务加甫, 陈创夫 申请人:石河子大学