专利名称：一种低蛋白米的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体是利用分子标记辅助选择技术将控制低蛋白的 QTL聚合到同一个水稻品种内，从而达到降低大米内蛋白质含量的方法。
背景技术：
肾病是严重危害人类健康的大敌，这类疾病不但难治，而且容易复发，从而导致疾病不断恶化。随着我国经济的飞速发展和人民生活水平的不断提高及人口老龄化等因素， 人们对健康的关注达到前所未有的程度。然而我国肾病的患者人数却呈不断增长的趋势。 由于肾功能衰竭引起的肾病患者在蛋白质代谢方面存在障碍，在进行治疗时，除服用药物夕卜，如果能配合低蛋白饮食，就能更有效地限制蛋白质摄入量，减少血中的氮素滞留，减轻肾脏的负担，从而延缓慢性肾功能衰竭的进程。由于普通品种大米的易消化蛋白质含量都高于4%，肾病患者不宜长期直接食用，为了配合治疗，他们只能食用经过加工的低蛋白食品。可是这些代替食品价格高、口味差，不但增加了患者经济负担、精神压力，还不容易长期坚持食用，反而降低了治疗效果。因此，采用适合肾病患者食用的低蛋白米来配合治疗，显得尤为重要。自1994年日本在世界上首次选育出低蛋白米功能稻品种。多年临床试验的结果表明，患者食用低蛋白稻米，可以减少非优质蛋白质摄入量，增加优质蛋白质摄入量，血清肌酸酐含量明显降低，达到减轻肾脏负担的目的。同时还能保证机体有充足的热量供应。能防止肾功能衰退，可有效缓解病情，减轻患者精神经济负担、提高疗效。特别是对以米饭为主食的患者效果更加显著。我国在肾病、糖尿病食疗方面积累了丰富经验，许多医学专家、 营养学家都著书，阐述低蛋白饮食在糖尿病、肾病治疗中的重要性。因为普通谷物中可消化蛋白质含量在8%-10%，不适于患者食用。因此，亟待开发适于肾病患者食用的低蛋白米。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备低蛋白米的方法，其可消化蛋白质含量在5% (重量比)以下。稻米的蛋白质含量属于数量遗传性状，受多基因控制，这些基因位点被称作 quantitative trait locus，即QTL，这些QTL能够通过QTL定位软件检测到。野生稻中有些类型蛋白质含量低，适于肾病患者食用，但是由于野生稻落粒性强，不易收获，同时野生稻产量极低，因此，无法直接利用，必须加以改良。改良的方法就是通过将野生稻与栽培稻杂交，并连续与栽培稻回交，保证杂交后代中的主要农艺性状与栽培稻亲本相似，这样才能获得较高的产量。同时，在有些后代中就会同时聚集野生稻的控制低蛋白的基因座位和栽培稻的控制低蛋白的基因座位，而这些材料的其他农艺性状如株型、抗病性、高产性等又较为理想，得到适于大面积生产并获得较高产量同时蛋白质含量低的品系。本发明的技术方案，一种低蛋白米的制备方法，包含以下步骤
(1)首先收集栽培稻品种和野生稻材料，并分别测定籽粒蛋白质含量；
(2)选择低蛋白含量的品种和低蛋白含量的野生稻杂交获得杂交一代即Fl的种子；(3)种植F1，利用分子标记技术剔除假杂种，令其自交获得F2的种子；
(4)剥取F2种子的胚消毒后培养在固体培养基上，获得幼苗后并令其结种子，取叶片用常规法提取叶片DNA，并用在野生稻和栽培稻间这两个亲本间扩增出的DNA条带有差异的SSR引物，利用PCR仪扩增F2的DNA，确定每对引物在各个幼苗中的带型，即属于野生稻的带型、属于栽培稻的带型和属于野生稻与栽培稻的混合带型，以此构建分子标记遗传图谱，作为QTL定位的基因型数据；同时测定F2胚乳部分的蛋白质含量，作为QTL定位的表现型数据。(5)利用QTL分析软件对基因型和表现型数据进行分析，获得控制蛋白质含量的 QTL情报信息。(6 )依据分子标记遗传图谱选同时具有所有来源于野生稻的，控制低蛋白的，并且是纯合QTL的F2植株与栽培稻亲本回交，获得BClFl的种子；
(7)种植BC1F1，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，获得BC1F2的大量种子；
(8)种植BC1F2，利用分子标记辅助选择技术确定同时具有来源于野生稻的控制低蛋白的纯合QTL (这些QTL因与某些SSR标记连锁而容易找到)的单株与栽培稻亲本再次回交， 获得BC2F1的种子；
(9)种植BC2F1，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，获得BC2F2的大量种子；
(10)按照(8)的方法选择农艺性状好，同时具有野生稻的低蛋白的纯合QTL，以及含有1个以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL的BC2F2单株与栽培稻亲本再回交一次，获得 BC3F1的种子；
(11)将得到的BC3F1的种子繁殖，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，获得大量的BC3F2的种子；
(12)种植BC3F2，选取农艺性状好的单株，通过分子标记辅助选择技术确定同时含有来源于野生稻的控制低蛋白的QTL的，同时含有2个以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL 的单株，在孕穗期采取尚未吐穗的穗子，在无菌条件下剥取其花药抖落到盛于三角瓶中的灭过菌的诱导培养基上，在暗光下培养诱导形成愈伤组织，然后转移到分化培养基上分别诱导生根及出芽，最后形成实生苗，经自然加倍后获得染色体纯合的个体。成熟后单株收获种子，次年种植这些种子成株行，成熟后按照株行收获，并采用凯氏定氮法测定其籽粒蛋白质含量，从中发现3株农艺性状与越光相似而蛋白质含量低于5. 0%的单株，蛋白质含量最低的只有4. 1。经连续2年种植，表明该单株低蛋白质含量特性能够稳定遗传。所述的制备方法，优选的方案是，步骤(2)所述野生稻为云南元江普通野生稻。更优选的是，所述云南元江普通野生稻的蛋白质含量< 6. 5%。所述的制备方法，优选的方案是，所述栽培稻品种为越光。更优选的是，所述栽培稻品种的蛋白质含量彡8. 7%。所述的制备方法，优选的方案是，步骤(5)所述QTL分析软件为Map Manager QTXb 17分析软件。所述的制备方法，优选的方案是，步骤(11)所得适于肾病患者食用的株系的蛋白
质含量< 5%。所述的制备方法，优选的方案是，步骤(3)中所述分子标记方法为利用SSR引物或 Indel引物对叶片DNA进行PCR扩增，并通过聚丙烯凝胶电泳检测所扩增的DNA条带是属于哪个亲本的方法。通过本发明提供的方法，能够显著降低大米的蛋白质含量，其适于肾病患者食用， 达到减轻患者经济负担，增加适口性和起到食疗保健的作用。
具体实施例方式下面结合实施例详细说明本发明的方案，但保护范围不被此限制。实施例利用系列号为W06的云南元江普通野生稻(0. rufipogon)，云南省农业科学院种质库提供)与优良栽培稻品种越光(蛋白质含量8. 7%)杂交获得低蛋白米新品系， 其包括步骤如下
(1)首先收集栽培稻品种和野生稻材料，并用国标凯氏定氮法分别测定籽粒蛋白质含量，选择蛋白质含量为6. 5%的元江普通野生稻与蛋白质含量较低的优良栽培稻品种越光作为亲本，在出穗期采用手工去雄法以野生稻为母本、越光为父本杂交获得杂交一代即Fl 的种子15粒；
(2)种植F1，采用常规CTAB法提取叶片的DNA，采用分子标记技术利用在亲本间有多态性的引物hdel-C4-6进行PCR扩增，hdel-C4-6引物序列为上游引物 CCACGTATAAAGCAGTTTGTTAGG,下游引物 CAAGTGTGGTTGTTAGCATCAAA，采用 PCR 仪进行扩增， 扩增片段大小为12^ρ，PCR反应体系为20 μ L,包括IOX PCR缓冲液2 μ L (含Mg2+ )、 2.5 mmol/L dNTP 1 μ L、模板 DNA 1 μ L、Taq 酶 0. 2 yL( 5 U/μ L), Prmier (10 μ mol/L) 0.6 μ L、加去离子水至20 μ L。扩增程序如下94度预变性5 min ;94度变性30s，55度退火30s，72度延伸1 min，35个循环；72度保温10 min。扩增产物经8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显影，确定其中12粒为真杂种；
(3)Fl自交获得5000余粒F2的种子；
(4)剥取300粒F2种子的胚消毒后培养在MS固体培养基上，获得幼苗并使其结种子， 取叶片提取叶片DNA，采用上述分子标记技术，用在野生稻和栽培稻的2个亲本间有多态性的138对SSR引物及hdel引物用PCR仪扩增F2的DNA，经8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每对引物在各个幼苗中的带型，即属于野生稻的带型、属于栽培稻的带型和属于野生稻与栽培稻的混合带型，采用Mapmarker/EXP3. 0进行连锁分析，用MapdrawV. 2. 1绘制连锁图谱，用Kosambi函数将标记间的重组交换率转变为遗传图距单位一一厘摩(CM)。构建好定位群体的分子标记遗传图谱，作为QTL定位的基因型数据。同时测定F2胚乳部分的蛋白质含量，作为QTL定位的表现型数据。(5)利用Map Manager QTXb 17分析软件对基因型和表现型数据进行分析，检测到来自野生稻的控制低蛋白的QTL五个，其中三个位于第7染色体上，分别与R1C95、冊82、 RM172连锁，第8和第10染色体上各有1个，分别与RM25及RM258连锁；来自栽培稻的控制低蛋白的3个QTL全部位于第1染色体上，分别与R1C43、RM23和RM212连锁；
(6)依据分子标记遗传图谱选同时具有上述五个来源于野生稻的控制低蛋白QTL的F2 单株共10株作为父本与栽培稻亲本越光回交，获得BClFl的种子535粒；
(7)种植BC1F1，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，所用SSR标记为R1C95，RM295 的引物序列为上游引物CGAGACGAGCATCGGATAAG，下游引物GATCTGGTGGAGGGGAGG，PCR扩增方法及电泳方法同上，获得BC1F2的种子50000余粒；(8)剥取BC1F2种子的胚消毒后接种在MS培养基上获得幼苗并获得种子，将其胚乳测定蛋白质含量，选择农艺性状好、蛋白质含量低的单株提取叶片DNA，并利用上述与QTL紧密连锁的引物，通过PCR扩增经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测找到同时具有野生稻低蛋白的 5个纯合QTL的单株3株与栽培稻亲本越光再次回交，获得BC2F1的种子387粒；
(9)种植BC2F1，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，所用SSR标记为R1C95，PCR扩增方法及电泳方法同上，获得BC2F2的种子45000余粒，
(10)按照(8)的方法将得到的低蛋白的，并经分子标记辅助选择确认的同时具有野生稻的低蛋白纯合QTL以及具有1个以上源于栽培稻的低蛋白QTL的BC2F2单株共2株与越光再回交一次，获得BC3F1的种子456粒；
(11)将得到的BC3F1的种子繁殖，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，所用SSR
标记为R1C95，PCR扩增方法及电泳方法同上，获得BC3F2的种子50000余粒；
(12)种植BC3F2，选取农艺性状好的单株，通过分子标记辅助选择技术确定同时含有
源于野生稻的控制低白的QTL的单株，以及至少含有2个以上源于栽培稻亲本的低蛋
白QTL的单株共8株，在孕穗期采取尚未吐穗的穗子，在无菌条件下剥取其花药抖落到盛于三角瓶中的灭过菌的诱导培养基上，在暗光下培养诱导形成愈伤组织，然后转移到分化培养基上分别诱导生根及出芽，最后形成实生苗，经自然加倍后获得染色体纯合的单株325 株。成熟后单株收获种子，次年种植这些种子成株行，成熟后按照株行收获，并采用凯氏定氮法测定其籽粒蛋白质含量，从中发现3株农艺性状与越光相似而蛋白质含量低于5. 0%的单株，这3个株系各方面性状均已稳定，SSR分子标记分析表明，其中的1株栽培稻中控制高蛋白的5个QTL被野生稻中的控制低蛋白质含量的QTL替换掉，同时栽培稻中的控制低蛋白质含量的3个QTL被保留。经连续2年种植，表明该单株低蛋白质含量特性能够稳定遗传，其中一株的蛋白质含量最低只有4. 1。
权利要求
1.一种低蛋白米的制备方法，其特征是，包括步骤如下(1)首先收集栽培稻品种和野生稻材料，并分别测定籽粒蛋白质含量；(2)选择低蛋白含量的品种和低蛋白含量的野生稻杂交获得杂交一代即Fl的种子； 3)种植F1，利用分子标记技术剔除假杂种，令其自交获得F2的种子；(4)剥取F2种子的胚消毒后培养在固体培养基上，获得幼苗后并令其结种子，取叶片用常规法提取叶片DNA，并用在野生稻和栽培稻间这两个亲本间扩增出的DNA条带有差异的SSR引物，利用PCR仪扩增F2的DNA，确定每对引物在各个幼苗中的带型，即属于野生稻的带型、属于栽培稻的带型和属于野生稻与栽培稻的混合带型，以此构建分子标记遗传图谱，作为QTL定位的基因型数据；同时测定F2胚乳部分的蛋白质含量，作为QTL定位的表现型数据；(5)利用QTL分析软件对基因型和表现型数据进行分析，获得控制蛋白质含量的QTL情报信息；(6)依据分子标记遗传图谱选同时具有所有来源于野生稻的，控制低蛋白的，并且是纯合QTL的F2植株与栽培稻亲本回交，获得BClFl的种子；(7)种植BC1F1，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，获得BC1F2的大量种子；(8)种植BC1F2，利用分子标记辅助选择技术确定同时具有来源于野生稻的控制低蛋白的纯合QTL的单株与栽培稻亲本再次回交，获得BC2F1的种子；(9)种植BC2F1，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，获得BC2F2的大量种子；(10)按照(8)的方法选择农艺性状好，同时具有野生稻的低蛋白的纯合QTL，以及含有1个以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL的BC2F2单株与栽培稻亲本再回交一次，获得 BC3F1的种子；(11)将得到的BC3F1的种子繁殖，经分子标记技术辅助选择剔除假杂种，获得大量的 BC3F2的种子；(12)种植BC3F2，选取农艺性状好的单株，通过分子标记辅助选择技术确定同时含有来源于野生稻的控制低蛋白的QTL的，同时含有2个以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL的单株，在孕穗期采取尚未吐穗的穗子，在无菌条件下剥取其花药抖落到诱导培养基上，在暗光下培养诱导形成愈伤组织，然后转移到分化培养基上分别诱导生根及出芽，最后形成实生苗，经自然加倍后获得染色体纯合的个体，成熟后单株收获种子，次年种植这些种子成株行，成熟后按照株行收获，并采用凯氏定氮法测定其籽粒蛋白质含量，从中发现农艺性状与越光相似而蛋白质含量低于5. 0%的单株，经连续2年种植，表明该单株低蛋白质含量特性能够稳定遗传。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(2)所述野生稻为云南元江普通野生稻。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述云南元江普通野生稻的蛋白质含量彡6. 5%ο
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述栽培稻品种为越光。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述栽培稻品种的蛋白质含量<8. 7%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(5)所述QTL分析软件为Map Manager QTXb 17 分析软件。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述分子标记技术为利用SSR引物或 Indel引物对叶片DNA进行PCR扩增，并通过聚丙烯凝胶电泳检测所扩增的DNA条带是属于哪个亲本的技术。
全文摘要
本发明公开了一种制备低蛋白米的方法，是通过将野生稻与栽培稻杂交，并连续与栽培稻回交后多代自交，通过分子标记辅助选择技术等，经过筛选得到适于大面积生产并获得较高产量同时蛋白质含量低的品系。本方法所得大米能够显著降低大米的蛋白质含量，适于肾病患者食用，达到减轻患者经济负担，增加适口性和起到食疗保健的作用。
文档编号A01H1/02GK102499059SQ20111033979
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者吴珊珊, 张思亮, 张思远, 张文会, 李楠 申请人:聊城大学