专利名称：青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒的悬浮培养方法
技术领域：
本发明涉及一种青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒悬浮培养的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术：
青钱柳(O^hcarjaPaliurus(BataL) Iljinskaja)为双子叶植物纲 (Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)植物，为我国特有的珍稀单种属植物，国家重点保护的濒危植物之一，是集绿化、用材、茶饮保健、药用治疗于一身的经济树种。经研究发现，青钱柳中含有人体所必须的多种常量和微量元素如锰、铁、铜、锌、 硒、铬、矾、锗等，并富含三萜、留体类化合物、皂苷、香豆精和黄酮等化合物。这些化合物成分能有效降低甘油三脂和胆固醇，使青钱柳具有降血压、降血糖、降血脂的功能，同时对增强人体免疫力、抗氧化、抗衰老有独特作用。青钱柳因其明显的降血糖作用，近年倍受降糖药物研究者的重视。青钱柳中所含的留萜类化合物及内酯等成分可能有抑制血糖升高的作用，而锌、锰、镁等无机成分与人体胰岛素分泌和葡萄糖的利用有关，硒具有胰岛素样作用。 何明等用江西梅山降血糖神茶(主要原料为青钱柳)对患有四氧嘧啶糖尿病大鼠进行了降糖实验，结果表明，连续4周服用316g后，大鼠空腹血糖明显降低，糖耐量增高，但降糖神茶对正常大、小鼠血糖无明显影响。α -葡萄糖苷酶(α -glucosidase, EC3. 2. 1. 20)又叫α -葡萄糖苷水解酶，以前称作麦芽糖酶(maltase)。α _葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。它在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。它可以从低聚糖类底物(淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖等)的非还原末端切开仅 α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖。而α -葡萄糖苷酶抑制剂能抑制小肠刷状缘上各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为麦芽糖进而分解为葡萄糖的速度和蔗糖分解为葡萄糖的速度减慢，其中对葡萄糖苷酶的抑制作用最强。研究证实，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量，还可预防和治疗肥胖症和高三酰甘油血症，用于治疗因碳水化合物代谢紊乱而引起的疾病。阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖几种典型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。此类降糖药的特点主要是降低餐后血糖而对降低空腹血糖无作用、安全和不增加胰岛素的分泌。从天然植物中提取具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分，用于降糖药物、保健品和食品的开发，是目前α-葡萄糖苷酶抑制剂研究的重点之一。由于青钱柳具有明显的降糖作用，因此从青钱柳中提取相关的成分，可以开发降糖药物、保健品以及食品。目前，已有一些青钱柳产品正在研究开发，其初级保健品己经上市，如江西省修水神茶(集团)公司开发的以青钱柳叶为主要原料的降糖、降压和减肥神茶系列产品，以其独特的香甜味和一定的祛病强身效果，受到消费者欢迎。据生产厂家介绍，该系列产品均以袋泡茶的形式出现，已得到美国食品与药品管理局(FDA)、日本厚生省和德国卫生部的认可，是我国第一个获得美国FDA颁发质量证书的保健茶，并被列为省重点开发项目。
随着对青钱柳研究的深入，其中对人体有益的成分也逐步被发现，但青钱柳自身种子繁殖困难，扦插成活率低等问题造成开发产品原料紧张，成为人们进一步开发青钱柳产品的最大障碍。现有的青钱柳资源主要是天然林，不仅数量少，而且多零星分布于深山老林和一些自然保护区中，且自然更新率很低，故可供利用的资源非常有限。青钱柳繁殖困难，主要表现为种子具有深休眠性，属难萌发的“二年种子”，时间上影响了其繁育进程； 种子败育很严重，因而人工育苗出苗率低；扦插繁殖难生根，成活率很低。可利用资源匮乏严重影响了青钱柳的开发利用和产业化进程，相关保健品至今难以满足市场需求。国内学者已经开始探索采用组织培养技术进行青钱柳树种的繁殖。建立优良无性系稳定的组织培养体系，对保存青钱柳的优质种质资源具有重大意义，但就目前的具体情况来看，大部分处于初步探索阶段，主要是对于其种子萌发的研究和利用愈伤组织扩繁的研究，进一步研究的效果不理想。胡冬南等以青钱柳1年生枝条的茎段为外植体诱导出愈伤组织，且诱导过程中无褐化现象，但进一步诱导形成不定芽的效果不理想。方升佐等认为今后青钱柳的组织培养工作，可从器官发生途径的探索、愈伤组织的进一步诱导、外植体褐化等方面继续深入研究，为青钱柳的产业开发利用做好技术储备。和固体培养相比，液体悬浮培养有良好的混合、流动性能及更高的传质效率，但溶氧有限，可能对植物细胞的生长有一定的限制作用。愈伤组织由固体培养基转至液体培养时，愈伤组织逐渐分散成单个细胞或多个细胞的聚集体。在悬浮培养过程中，随着细胞的生长和增殖，细胞的聚集度又慢慢提高，细胞聚集体不断增大，聚集体的大小与液体悬浮过程中产生的剪切力有关，并与次级代谢产物含量之间也存在着一定关系。植物组织和细胞培养已经经过了近百年的发展历程，有许多植物细胞如紫草、人参根、长春花细胞、草莓细胞、青蒿、毛地黄等建立了悬浮细胞系并达到中试或工业化规模。 在建立悬浮细胞培养系的过程中，固体培养基上愈伤组织的生理状态直接影响液体培养基中悬浮细胞培养系的质量；应该挑选那些松软易碎、颗粒较小的愈伤组织转接到液体培养基中，并通过反复继代来达到建立稳定的悬浮细胞培养系的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能大量、快速生产α -葡萄糖苷酶活性抑制剂含量高的青钱柳愈伤组织，以满足对青钱柳材料日益增长消费需求的青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒的悬浮培养方法；
本发明以少量青钱柳嫩枝或嫩叶为原料对其进行植物组织培养，在短期内得到愈伤组织，并在此基础上对愈伤组织进行悬浮颗粒培养，进一步提高愈伤组织的增殖速度，并以其对α -葡萄糖苷酶活性抑制效果为依据，筛选的出适合青钱柳愈伤组织生长且其次生代谢产物对α-葡萄糖苷酶活性抑制较强的培养基配方。本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，它主要包括如下步骤
1)植物体的选择及无菌处理选择3 7月及9 11月间的健康的青钱柳植株，取当年生嫩枝及嫩叶进行清洗，洗涤剂浸泡5-20min，清水冲洗0. 5 池；无菌条件下将清洗后 70% 80%酒精消毒5-30s，再利用0. 1%的升汞灭菌5 20min或2%-1洲次氯酸钠灭菌 5 20min ；
2)愈伤组织诱导培养将灭菌的愈伤组织接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养；基本培养基为MS培养基，在培养基中加入0 5mg/mlNAA，0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，4-7g琼酯，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C ；培养时间1 25天； 光照时间0 24h ；光照强度0 lOOOOLux ；
3)愈伤组织颗粒悬浮培养选取生长健康，代谢旺盛，结构疏松的愈伤组织，接种至装有200ml液体培养基的锥形瓶中震荡培养。培养基为MS基本培养基，加入0 5mg/mlNAA， 0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C;培养时间1 20天；光照时间0 24h ；光照强度0 lOOOOLux，转速50 200r/min ；
4)愈伤组织扩大培养待愈伤组织处于对数生长期时，选取悬浮培养体系内均勻分散生长旺盛的愈伤组织颗粒接种至5L发酵罐中，剔除瓶底老化褐变的愈伤组织团块，用发酵罐进行扩大培养；培养基为MS基本培养基，加入0 5mg/mlNAA，0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C ；培养时间1 20天；光照时间 0 24h ；光照强度0 lOOOOLux，转速50 200r/min。本发明在第1)步骤中，将灭菌后的外植体切成0. 3 0. 5cm2的组织块并用于第 2)步骤中；而在第2)步骤中，培养期间根据愈伤组织生长情况，进行转瓶扩繁；在第4)步骤中，至少应根据PH变化进行补料及转速调整。本发明能够大大提高青钱柳愈伤组织的生长速率，在相同时间内，固体培养基上愈伤组织上增长量达到721%时，液体悬浮培养愈伤组织增长量达到1292%。通过对α-葡萄糖苷酶活性抑制的实验可知，液体悬浮培养过程中，次生代谢产物被分泌到胞外，愈伤组织细胞内及培养液内均含有α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，且固体培养的愈伤组织与液体悬浮培养的愈伤组织抑制剂含量无明显差异。且培养液也有较强的抑制酶活的作用。
图1为本发明所述青钱柳愈伤组织水提物对α -葡萄糖苷酶活性抑制实验数据表图2为本发明所述青钱柳愈伤组织水提物对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验数据曲线
图3为青钱柳叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制实验数据曲线图。
具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍本发明所述的青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒的悬浮培养方法，该方法主要包括如下步骤
1)植物体的选择及无菌处理选择3 7月及9 11月间的健康的青钱柳植株，取当年生嫩枝及嫩叶进行清洗，洗涤剂浸泡5-20min，清水冲洗0. 5 2h ；无菌条件下将清洗后 70% 80%酒精消毒5-30s，再利用0. 1%的升汞灭菌5 20min或2%_12%次氯酸钠灭菌 5 20min ；
2)愈伤组织诱导培养将灭菌的愈伤组织接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养；基本培养基为MS培养基，在培养基中加入0 5mg/mlNAA，0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，4-7g琼酯，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C ；培养时间1 25天； 光照时间0 24h ；光照强度0 lOOOOLux ；3)愈伤组织颗粒悬浮培养选取生长健康，代谢旺盛，结构疏松的愈伤组织，接种至装有200ml液体培养基的锥形瓶中震荡培养。培养基为MS基本培养基，加入0 5mg/mlNAA， 0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 培养时间1 20天；光照时间0 24h ；光照强度0 lOOOOLux，转速50 200r/min ；
4)愈伤组织扩大培养待愈伤组织处于对数生长期时，选取悬浮培养体系内均勻分散生长旺盛的愈伤组织颗粒接种至5L发酵罐中，剔除瓶底老化褐变的愈伤组织团块，用发酵罐进行扩大培养；培养基为MS基本培养基，加入0 5mg/mlNAA，0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 ；培养时间1 20天；光照时间 0 24h ；光照强度0 lOOOOLux，转速50 200r/min。本发明在第1)步骤中，将灭菌后的外植体切成0. 3 0. 5cm2的组织块并用于第 2)步骤中；而在第2)步骤中，培养期间根据愈伤组织生长情况，进行转瓶扩繁；在第4)步骤中，至少应根据PH变化进行补料及转速调整。实施例
实施例1、构建一种用于培养青钱柳愈伤组织的细胞悬浮培养体系，其步骤如下 1取青钱柳幼嫩叶片为外植体，用洗洁精清洗浸泡8min，流水冲洗lh。在无菌条件下， 用75%酒精浸泡20s后取出，0. 1%升汞浸泡15min，清水洗涤8次，切成0. 3 0. 5cm2的组织块备用。2将灭菌的青钱柳外植体无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基上，培养基为 MS+1. 0mg/ml6-BA+0. 4mg/mlNAA,30g/L 蔗糖、5g/L 琼酯、24°C、每天 8 小时 2000Lux 光照培养两周。选取生长状况好的疏松的愈伤组织切开进行转瓶扩繁，继续培养两周。3选取生长状况好，结构疏松的青钱柳愈伤组织五块，每块约Icm2，用手术刀和镊子捣碎，接种于装有200ml液体培养液的锥形瓶中，震荡培养。培养基为MS+1. Omg/ ml6-BA+0. 4mg/mlNAA,30g/L 蔗糖，25°C、无光照、90r/min 培养两周。4将愈伤组织悬浮培养液接种于5L发酵罐中，接种时剔除底部大块的褐变的愈伤组织颗粒，两瓶愈伤组织培养液接种于一个发酵罐中。MS+1. 0mg/ml6-BA+0. 4mg/mlNAA, 30g/L蔗糖，25°C、无光照、140r/min培养20天，期间观察愈伤组织生长情况，根据pH、溶氧等指标的变化及时用氢氧化钾或盐酸调整PH值，当愈伤组织过对数生长期后停止培养，采用四层纱布过滤收集愈伤组织。实施例2、
1取青钱柳幼嫩叶片为外植体，用洗洁精清洗浸泡8min，流水冲洗lh。在无菌条件下， 用75%酒精浸泡20s后取出，8%次氯酸钠浸泡15min，清水洗涤8次，切成0. 3 0. 5cm2的组织块备用。2将灭菌的青钱柳外植体无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基上，培养基为 MS+2. 0mg/ml6-BA+0. 10mg/mlNAA、30g/L 蔗糖、5g/L 琼酯、24°C、每天 8 小时 2000Lux 光照培养两周。选取生长状况好的疏松的愈伤组织切开进行转瓶扩繁，继续培养两周。3选取生长状况好，结构疏松的青钱柳愈伤组织五块，每块约Icm2，用手术刀和镊子捣碎，接种于装有200ml液体培养液的锥形瓶中，震荡培养。培养基为MS+2. Omg/ ml6-BA+0. 10mg/mlNAA、30g/L 蔗糖，25°C、无光照、80r/min 培养两周。4将愈伤组织悬浮培养液接种于5L发酵罐中，接种时剔除底部大块的褐变的愈伤组织颗粒，两瓶愈伤组织培养液接种于一个发酵罐中。MS+2. 0mg/ml6-BA+0. 10mg/mlNAA、 30g/L蔗糖，25°C、无光照、140r/min培养20天，期间观察愈伤组织生长情况，根据pH、溶氧等指标的变化及时用氢氧化钾或盐酸调整PH值，当愈伤组织过对数生长期后停止培养，采用四层纱布过滤收集愈伤组织。图1、2为本发明所述青钱柳愈伤组织水提物对α _葡萄糖苷酶活性抑制的实验。 可以看出，随着青钱柳提取物含量增加，α “葡萄糖苷酶的活性逐渐减小，说明青钱柳提取物对α-葡萄糖苷酶的活性的抑制存在浓度依赖，在一定范围内α-葡萄糖苷酶的活性随着提取物浓度的增加逐渐减小。图1中以紫外分光光度计400nm波长测量；图2中横轴表示提取物加入量，纵轴表示吸光值变化值；图3中，曲线1表示不同底物浓度下阴性对照对糖苷酶的抑制效果；曲线2表示不同底物浓度下青钱柳叶提取物对糖苷酶的抑制效果；横轴底物pNPG (对硝基苯- β -D-半乳糖吡喃糖苷)，纵轴剩余酶活。
权利要求
1.一种青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒的悬浮培养方法，其特征在于它主要包括如下步骤1)植物体的选择及无菌处理选择3 7月及9 11月间的健康的青钱柳植株，取当年生嫩枝及嫩叶进行清洗，洗涤剂浸泡5-20min，清水冲洗0. 5 2h ；无菌条件下将清洗后 70% 80%酒精消毒5-30s，再利用0. 1%的升汞灭菌5 20min或2%_12%次氯酸钠灭菌 5 20min ；2)愈伤组织诱导培养将灭菌的愈伤组织接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养；基本培养基为MS培养基，在培养基中加入0 5mg/mlNAA，0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，4-7g琼酯，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C ；培养时间1 25天； 光照时间0 24h ；光照强度0 lOOOOLux ；3)愈伤组织颗粒悬浮培养选取生长健康，代谢旺盛，结构疏松的愈伤组织，接种至装有200ml液体培养基的锥形瓶中震荡培养；培养基为MS基本培养基，加入0 5mg/mlNAA， 0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C;培养时间1 20天；光照时间0 24h ；光照强度0 lOOOOLux，转速50 200r/min ；4)愈伤组织扩大培养待愈伤组织处于对数生长期时，选取悬浮培养体系内均勻分散生长旺盛的愈伤组织颗粒接种至5L发酵罐中，剔除瓶底老化褐变的愈伤组织团块，用发酵罐进行扩大培养；培养基为MS基本培养基，加入0 5mg/mlNAA，0 5mg/ml的6-BA，20 30g/L的蔗糖，pH值为5. 0 7. 0，培养温度17 28°C ；培养时间1 20天；光照时间 0 24h ；光照强度0 lOOOOLux，转速50 200r/min。
2.根据权利要求1所述的青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒的悬浮培养方法，其特征在于在第1)步骤中，将灭菌后的外植体切成0. 3 0. 5cm2的组织块并用于第2)步骤中；而在第2)步骤中，培养期间根据愈伤组织生长情况，进行转瓶扩繁；在第4)步骤中，至少应根据PH变化进行补料及转速调整。
全文摘要
一种青钱柳愈伤组织及愈伤组织颗粒的悬浮培养方法，它主要包括如下步骤1)植物体的选择及无菌处理选择3～7月及9～11月间的健康的青钱柳植株，取当年生嫩枝及嫩叶进行清洗，洗涤剂浸泡5-20min，清水冲洗0.5～2h；无菌条件下将清洗后70%～80%酒精消毒5-30s，再利用0.1%的升汞灭菌5～20min或2%-12%次氯酸钠灭菌5～20min；2)愈伤组织诱导培养；3)愈伤组织颗粒悬浮培养；4)愈伤组织扩大培养；本发明能够大大提高青钱柳愈伤组织的生长速率，在相同时间内，固体培养基上愈伤组织上增长量达到721%时，液体悬浮培养愈伤组织增长量达到1292%；通过对α-葡萄糖苷酶活性抑制的实验可知，液体悬浮培养过程中，次生代谢产物被分泌到胞外，愈伤组织细胞内及培养液内均含有α-葡萄糖苷酶活性抑制剂。
文档编号A01H4/00GK102487819SQ20111037262
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者孟凡国, 张永江, 莫颖芸, 许衡 申请人:嘉兴浙华农业技术开发有限公司