专利名称：一种烟曲霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌株，具体涉及一种从原位土壤中筛选的烟曲霉菌株及其在烟草黑胫病防治中的应用。
背景技术：
烟草黑胫病是一类重要的烟草土传病害，它们通常侵染烟草根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的经济损失。目前，生产上主要采用抗病品种和作物轮作等农业措施来防治烟草土传病害病。中国科学院昆明植物研究所研究出抗黑胫病的品种(专利号 CN01108714. 5)，但是由于抗病品种需要抗病基因多样化，并且受环境的影响比较大，防治效果不理想；作物轮作也是防治烟草青枯病和黑胫病的有效方法之一，但是由于我国人多地少，生产中正常的轮作措施无法实现；也有使用化学药剂防治烟草黑胫病的，云南烟草科学研究所研究一种对甲霜灵可以治理黑胫病(专利号CN200710065691. 3)，大量使用化学药剂来防治烟草黑胫病会造成环境污染，药物残留对人体的身体健康有害，同时，化学农药的长期使用，病原菌易对其产生抗药性，因而导致防治效果下降甚至防治失败。大量研究表明，烟田土壤中不仅存在引起烟草病害的微生物而且也存在多种多样的非致病性的、提高烟草生命力的有益微生物，因而烟草的生物防治以及生态防治日益受到重视。生物防治措施是利用有益微生物降低植物病原菌对植物的危害，生态防治则是通过向土壤引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多样性等措施，进而使土壤微生态达到平衡，最终通过土壤中不同生物之间的拮抗与竞争实现对土壤病害的防治。专利号CN200710300087和专利号CN200910233578专利文献分别筛选防治黑胫病的菌株，分别为淡紫青霉ZY-19-2和多粘类芽孢杆菌C-5。淡紫青霉ZY-19-2产几丁质酶能力强可以分解蝇蛆体壁，抵抗烟草黑胫病的侵染，但是外来菌株施入土壤还存在定殖难的问题。 CN200910233578的文献公开了一种把拮抗菌做成有机肥料，菌株和有机肥料一起施入土壤，有利于菌株的定殖，但是肥料利用完以后，作为一种外来菌，菌株的生长能力变差，拮抗作用就会降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够防治烟草黑胫病的烟曲霉菌(Aspergi I Ius fumigatus)Ty-I。同时，还涉及一种该菌株防治烟草黑胫病菌剂中的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种从原位土壤中筛选的烟曲霉菌 (Aspergillus fumigatus) Ty_l，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年 10 月 16 日，保藏号CCTCC NO M 2011353。同时，本发明的技术方案还提供了一种烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)Ty-I 在制备防治烟草病害的菌剂中的应用。更进一步地,本发明的技术方案提供了一种烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)
3Ty-I在制备防治烟草黑胫病菌剂中的应用。本发明提供的菌株是从烟草黑胫病植株的根围土壤中筛选出的一株拮抗菌，该菌株已于2011年10月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO M 2011353。烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus) Ty-I具体通过如下方法筛选获得I.病原菌采集与分离从信阳罗山县和漯河舞阳县采集的较典型黑胫病病症烟株。分离病菌前，先将烟杆冲洗干净，再用75%的酒精对烟杆和小刀消毒，接着在无菌条件下用小刀剖开烟株茎杆上的病斑，将感病维管束组织切成若干小块，用灭菌过的镊子夹取烟块于牛肉膏蛋白胨培养皿中培养，每皿中放4 5块，重复3皿，培养温度为30°C 32°C。培养48h，待烟块周围长出像棉絮状的菌丝体时，挑取少许菌丝分离纯化，接入PDA斜面培养基。2.黑胫病病原菌致病性测定选用烟草K326为试验品种，于盆钵内将烟草种子播种后，待烟株生长到有维管束组织时，将烟草的根部破坏并将培养好的黑胫病原菌稀释一定浓度制成菌悬液，于烟草根围倒入30ml菌悬液，并保持高温高湿，20天后观察发病情况。3. 土壤真菌分离取染病烟株根际周围的土壤10g，放入90ml无菌水的三角瓶中，震荡培养30分钟后静置20分钟，然后稀释至10_4、10_5和10_6 (g/ml) 3个浓度梯度，分别在3个浓度的溶液中加入Iml 8万单位的硫酸庆大霉素。分别吸取上述3个溶液0.2ml在PDA培养基平板上均匀涂布，重复3皿，置于28°C温箱中培养72小时后，挑取单菌落进行纯化并移入斜面培养基上保存。4.拮抗菌筛选分别将培养72小时的土壤真菌和黑胫病病原菌在PDA培养基上进行对峙培养。培养基中间接黑胫病病原菌，两边接种分离得到的土壤真菌，两菌相距2. 5cm，3天后检查对峙培养结果，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的真菌对病原菌有无拮抗作用。5.拮抗作用测定制备PDA平板后，采用对峙培养法将上述分离出的拮抗菌分别接种在烟草黑胫病病原菌的两侧，28°C恒温培养，连续观察两菌落生长情况及其菌落间的相互影响，以两菌之间拮抗带的大小来判断拮抗作用大小。6.寄生现象观察挑起上述对峙培养4天后的菌落交界处的菌丝块，于普通光学显微镜下观察，进而判明拮抗菌抑制病原菌的作用方式和机理。经筛选，得到Ty-I菌种。经鉴定，关于该菌株的信息包括烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus),质地丝绒状或稍带絮状，暗灰烟绿色无渗出液，菌落反面灰褐色。分生孢子结构大量。分生孢子头球形或半球形。分生孢子梗发生于基质和气生菌丝，淡绿色，壁平滑。Ty-I对烟草黑胫病的拮抗机理为Ty_l菌的菌丝附着缠绕在黑胫病菌丝上生长， 病原菌菌丝原生质浓缩、液泡化、萎陷而最终分解。所附着缠绕的寄主菌丝体的细胞壁被其吸器粘帖，并通过吸器吸取寄主菌丝体内营养物质而得到生长，从而对病原菌的生长产生强烈抑制作用。Ty-I菌发酵条件如下种子培养基以葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，发酵初始pH 为4. 5-5. 5，250mL三角瓶装瓶量为80mL，30°C摇床转数为150r/min，发酵时间为48小时， 以10%的接种量接种到麸皮固体培养基培养96小时，产生大量孢子后，烘干或自然晾干， 至水分含量小于30%。本发明从烟草黑胫病原位土壤中筛选分离到一株拮抗菌Ty-1，通过寄生和营养竞争抑制黑胫病病原菌的生长，与其它类似产品相比，有如下优点l)Ty-l从烟草黑胫病发病的原位土壤中分离出来，制成菌剂后施入土壤，有利于拮抗菌的定殖，能快速繁殖成为优势菌；2) Ty-I通过寄生和营养竞争，抑制黑胫病病原菌的生长，从而有效防治烟草黑胫病；3)Ty_l为霉菌，产孢子能力较强，这一方面有利于产品的保存，另一方面有利于菌种在土壤中抵抗不良环境，环境适宜即可大量生长繁殖。通过寄生和营养竞争，抑制黑胫病病原菌的生长，从而有效防治烟草黑胫病。该菌种从烟草黑胫病发病的原位土壤中分离出来，制成菌剂后施入土壤，有利于拮抗菌的定殖， 能快速繁殖成为优势菌。Ty-I为霉菌，产孢子能力较强，这一方面有利于产品的保存，另一方面有利于菌种在土壤中抵抗不良环境，环境适宜即可大量生长繁殖。
图I为接种黑胫病病原菌后30天烟草发病情况；
图2为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-I ；
图3为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-2 ；
图4为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-3 ；
图5为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-4 ；
图6为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-5 ；
图7为从原位土壤中分离得到的真菌菌株Ty-6 ；
图8为Ty-I菌分生孢子梗；
图9为Ty-I菌分生孢子；
图10为Ty-I菌与黑胫病菌对峙生长4天的抑制情况；
图11为Ty-I菌与黑胫病菌寄生现象；
图12为Ty-I菌与黑胫病菌寄生，黑胫病菌菌丝原生质浓缩、液泡化情况；
图13为Ty-I菌在麦芽汁培养基鉴定培养的菌落形态；
图14为Ty-I菌在麦芽汁培养基鉴定培养的显微特征图。
具体实施方式
实施例I烟草黑胫病拮抗菌的分离与筛选
I)病原菌分离
从信阳罗山县和漯河舞阳县采集的烟草发病烟株中分离出烟草黑胫病。待烟块周
围长出像棉絮状的菌丝体时，挑去少许菌丝纯化，接入PDA斜面培养基备用。PDA培养基:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml,自然pH，压力I. 05kg/cm2、121. 3°C下灭菌20min。显微照片显示该菌菌丝无色、无隔；孢囊梗从发病组织气孔中伸出，1-3根束生; 孢子囊顶生或侧生，梨形至椭圆形，有乳突，孢子囊可释放5-30个游动孢子；游动孢子近圆形或肾形，无色，侧生二根鞭毛。2)致病性鉴定选用烟草K326为试验品种。于盆钵内将烟草种子播种后，待烟株生长到有维管束组织时，将烟草的根部破坏并将培养好的黑胫病原菌稀释一定浓度制成菌悬液，于烟草根围倒入30ml菌悬液，并保持高温高湿。20d后观察发病情况。根据Koch氏法则，将从黑胫病发病烟株中分离的菌株接种到健康烟草植株上， 以测定其致病性。将分离出的供试菌株接种10株健康烟草，经过30天后有2株烟草出现了黑胫病症状如图I所示。3) 土壤真菌的分离取样品烟株根际周围的土壤10g，放入90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置 20min，然后稀释至10-4、10-5和10_6 (g/ml) 3个浓度梯度，分别在3个浓度的溶液中加入 Iml 8万单位的硫酸庆大霉素。分别吸取上述3个溶液0.2ml在PDA培养基平板上均匀涂布，重复3皿，置于28°C温箱中培养72h，挑取单菌落进行纯化并移入斜面培养基上保存。经过平板稀释涂布分离，从土壤中共获得6种真菌，其菌落颜色分别绿色、棕色、 黑色、土黄色、白色、褐蓝色6个菌株。将其分别编号为Ty-I如图2所示、Ty-2如图3所示、 Ty-3如图4所示、Ty-4如图5所示、Ty-5如图6所示和Ty_6如图7所示。4)拮抗菌株的筛选及其拮抗作用分别将培养72h的土壤真菌和黑胫病病原菌在PDA培养基上进行对峙培养。培养基中间接黑胫病病原菌，两边接种分离得到的土壤真菌，两菌相距2. 5cm，4d后检查对峙培养结果，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的真菌对病原菌有无拮抗作用。通过对峙培养，从6株真菌菌株中筛选出I株对烟草黑胫病病菌具有极强寄生和拮抗作用的菌株Ty-1。实施例2Ty_l形态学观察Ty-I菌初期菌落平展，白色，菌丝稀疏，成熟的菌落黑色，背面无色。菌丝无色有明显分隔，具有分枝，直径3-4 u m。成熟时菌丝长出分生孢子梗，主干和每个侧枝的顶端都着生梗，梗呈两头尖的纺锤棒状，分生孢子为圆球形或卵圆形如图8、图9所示。实施例3Ty_l寄生现象观察Ty-I菌和黑胫病病原菌对峙培养中发现Ty_l菌生长旺盛,可产生大量短绒状气生菌丝和黑色分生孢子丛。Ty-I菌能越过菌落交界处直接占据黑胫病菌落生长空间，并且能够在病菌上生长，产生孢子，逐渐将病菌消解如图10所示。该菌的拮抗作用表现为产生抑菌带或抑菌圈，使病原菌菌丝生长明显受到抑制，具有明显的营养竞争和分泌抗生物质产生拮抗作用。用显微镜观察菌落交界处的菌丝，发现Ty-I菌菌丝可附着并缠绕在黑胫病菌丝之上如图11、图12所示，表明该真菌可通过寄生在黑胫病病原菌进行生长，通过长时间的寄生生长可把病原菌杀死并将其分解，从而对病原菌的生长产生强烈抑制作用。实施例4Ty_l菌的鉴定分类Ty-I经中科院微生物研究所鉴定结果为I)菌落形态及显微特征麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长快，25 °C黑暗条件下7天菌落直径50mm，质地丝绒状或稍带絮状，暗灰烟绿色无渗出液，菌落反面灰褐色，如图13所示。分生孢子结构大量。分生孢子头球形或半球形。分生孢子梗发生于基质和气生菌丝，淡绿色，壁平滑。顶囊烧瓶状或粗棒形，直径15-25 ym，全部表面可育。产孢结构单层， 瓶梗5-10 X 2-2. 5 iim。分生孢子球形或近球形，直径2. 5_3 y m，淡灰绿色，壁稍粗糙，如图 14所示。2) rRNA基因序列测序结果RrnaA 基因 ITS1-5. 8S-ITS2 区序AGGTTGGGGATCCTACCTGATCGAGGTCACCTTAGAMATMAGTTGGGTGTCGGCTGGOGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACMAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCOGCTGCCTTTOGGGCCOGTCCCCCGGGAGAGGGGGAOGGGGGCCCMCACACMGCCGTGCTTGAGGGCAGCMTGAOGCTOGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGOGCAATGTGCGTTCAAAGACTOGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTOGCTGCGTTCTTCATCGATGCOGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTAOiATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGOGTTCATGTTGGGGTCTTOGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCMGGCCTCCCOGGCGGCCGTOGMAOGGCGGGCCCGCOGMGCMCMGGTACGATAGACAOGGGTa^AGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTOGGTMTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGMACCTTGTTACGATTTTTAACTCCA实施例5Ty_l菌剂的生产将纯化的拮抗菌接种到斜面培养基上，放在30°C的培养箱中培养48小时，用量筒量取5ml无菌水倒斜面，轻轻振荡，然后准确吸取Iml菌悬液加入到装有80ml无菌液体培养基的250ml三角瓶中，放到30°C的水浴摇床震荡培养2天，然后将培养好的菌悬液加入到灭菌的固体培养基(麦麸或牛粪)，30°C培养4天，风干，备用。实施例6Ty_l菌剂对于烟草黑胫病的防治效果在贺州市富川县麦岭镇三民村进行I)试验材料供试土壤红黄土早地，前作玉米，有青枯病发生历史；供试品种烟 87 ;施用方法将拮抗菌制成菌种(以麦麸为载基质，有效活菌数在108CUF/g干基以上)， 施用时用水以I : 10 (体积比)的比例制成菌液灌根，每株500ml。2)区组设计试验设三个处理，处理一对照；处理二 本实施例的菌剂灌根I次(在团棵期淋施)；处理三本实施例的菌剂灌根2次(分别在团棵期和团棵后15天淋施)。3)栽培要求采用漂浮育苗技术育苗，用膜下小苗移栽技术移栽，移栽后按优质烤生产技术规范要求进行管理。各小区的栽培技术措施、管理操作要求基本保持一致。4)调查测定项目在打顶10天时测定各处理烟株的农艺性状；并分别在团棵期、 团棵后20天、打顶后10天、采收中部叶和采收上部叶时调查各处理烟株的长势长相黑胫病的发病率和病情指数。表I抗生菌生物制剂灌根对烟株农艺性状的影响
权利要求
1.一种烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Ty_l,其特征在于保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年10月16日，保藏编号CCTCC NO M 2011353。
2.烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Ty-I在制备防治烟草病害的菌剂中的应用。
3.烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Ty-I在制备防治烟草黑胚病菌剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及了一种从原位土壤中筛选的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Ty-1及其应用，该烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Ty-1的保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年10月16日，保藏编号为CCTCC M 2011353。本发明菌株的菌丝可附着并缠绕在烟草黑胫病菌丝之上，病原菌菌丝原生质浓缩、液泡化、萎陷而最终分解。所附着缠绕的寄主菌丝体的细胞壁被其吸器粘帖，并通过吸器吸取寄主菌丝体内营养物质而得到生长，从而对病原菌的生长产生强烈抑制作用。
文档编号A01N63/04GK102533566SQ20111040090
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者李玉红, 李红丽, 王岩, 郭夏丽 申请人:郑州大学