专利名称：一种短小芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种具高酶活性和抑弧菌活性的短小芽孢杆菌，及利用其作为活性成份的益生菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，水产养殖病害频繁发生，为了控制疾病，一些抗生素药物在水产养殖中被广泛使用和滥用，不仅造成环境中药物残留、细菌耐药性增加，而且由于水体环境的流动性，耐药基因更容易水平转移，造成更多耐药株的出现。 为了应对耐药性，养殖中不得不加大用量并不断更换药物种类，进而造成恶性循环。另一方面药物的大量使用，药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题也日益引起关注。为了应对这些问题，采用替代的生物防治措施成为当前水产养殖的热点，其中益生菌的应用在水产养殖中越来越受到重视，它们不仅具有抑制细菌性病原的作用，还具有促进水产养殖动物生长、改善免疫等作用。市场上水产用益生菌产品，名目繁多，层出无穷，但是概括起来存在以下问题(1) 绝大多数产品的益生菌直接来源于人类和陆生动物的益生菌种类。这些陆源益生菌是否能长期存活于水体环境或水生动物的肠道则几乎无相关的报道。Panigrahi等(2004)则直接认为那些借鉴畜禽思路所研制的水产益生菌存在难定植的不足，不能在水产动物消化道内存留并大量繁殖。(2)水产益生菌产品以水质调节剂为主，饲用添加剂为次要。一些益生菌产品标示其既可作水质调节剂也可作为饲用添加剂，显然违背了微生物生长环境存在差异的规律。(3)作为饲用添加剂的益生菌产品以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌为常见，少见其它类型的芽孢杆菌，而上述三种芽孢杆菌并非海洋环境的常见菌群。(4)水产益生菌产品中菌株的酶活效果不明确、抑菌效果不明确，而这二项指标是评价饲用益生菌的效果的核心指标。以当前水产益生菌使用最多的芽孢杆菌为例，目前已经报道的芽孢杆菌抗菌素有169种，这些抗菌素主要是肽类，多作用于革兰氏阳性细菌。人和陆生动物的肠道主要病原菌是革兰氏阳性细菌，因此对于人和陆生动物而言，芽孢杆菌是比较合适的益生菌。但是对于海洋水产动物而言，主要的病原菌是革兰氏阴性菌，如弧菌。芽孢杆菌对于这些来自水产动物的革兰氏阴性菌的抑制效果还少见报道。因此不可照搬挪用，需要针对水产动物的特点筛选对弧菌等革兰氏阴性菌有抑制效果的芽孢杆菌等。结合上述问题， 我们迫切需要从水产动物生长的土著环境和肠道中分离益生菌株，并且以酶活性和抑菌活性作为筛选和评价效果的主要指标。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种分离自健康凡纳滨对虾肠壁粘膜且具有高酶活性和抑弧菌活性的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149，该菌于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NO :M2011411。本发明所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) LV149分离自健康凡纳滨对奸肠壁粘膜。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149的生物学特征如下I、菌落形态和细胞形态特征菌株在LB琼脂培养基和2216E培养基上的菌落形态为乳白色、扁平、表面较湿、不透明、褶皱、边缘不整齐，培养24小时菌落直径2-4_。杆状， 芽孢椭圆形，中性或偏端生。2、生理生化特征菌株生长适宜盐度范围5_35%。，7%以上NaCl不生长，生长适宜pH范围为5-9。革兰氏阳性，接触酶(_)，氧化酶(+)，V-P试验(_)，硝酸盐还原(_)，淀粉水解 (+)，明胶液化(+)，能发酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-葡萄糖，发酵葡萄糖不产气，苯丙氨酸脱氨酶(_)，柠檬酸盐利用(+)，卵磷脂酶(_)，吲哚试验(_)，酪素水解(+)，酪氨酸水解(_)。常规方法提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149基因组DNA并做16S rRNA 基因序列测定，其序列如SEQ ID NO. I所示。经BLAST比对，其与公布的多株短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)的16S rRNA基因一致度100%，与其它芽孢杆菌一致度为99%以下。 因此，分子鉴定该细菌为短小芽孢杆菌。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)所列的方法对细菌进行常规的生理和生化鉴定。其与标准株的相似度为100%，属短小芽孢杆菌，此结果与分子鉴定的结果一致。因此该菌属于短小芽孢杆菌，命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149，该菌于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NO :M2011411。对短小芽孢杆菌LV149和LV479进行了随机扩增多态性 DNA(RAPD)扩增，以检测二者指纹图谱的差别。由图2可见，采用的7条随机引物均能给出二株短小芽孢杆菌的指纹图谱，并且每条引物均能显示出二者明显的差别，这个结果表明短小芽孢杆菌LV149和短小芽孢杆菌LV479虽然属同一个种，但是遗传差异较大，导致其有不同的表型特征。经实验发现,本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149能同时产生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，并且这三种酶具有高的活性。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) LV149对哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、轮虫弧菌 E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、创伤弧菌11758、溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056和溶藻弧菌E066等弧菌具有广泛的抑制性，且不具有溶血活性。进一步的将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149进行固态发酵，干燥粉碎制备得到含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149的短小芽孢杆菌益生菌制剂,用其添加到饲料中饲喂凡纳滨对虾，结果发现随着养殖周期增长，投喂添加了短小芽孢杆菌益生菌制剂的饲料的实验组与不添加益生菌制剂的对照组相比，体重增加逐渐明显，肝体指数降低逐渐明显。至实验结束时，实验组对虾的平均体重与对照组相比差异明显，增加了 11. 7% ;实验组对虾的肝体指数与对照组相比差异明显，降低了 10. 2%;计算后饵料系数降低了 12. 1%。由此说明，在对虾的养殖中使用短小芽孢杆菌益生菌制剂可以明显地降低饵料系数，促进对虾生长，从而缩短养殖周期，减少养殖成本和风险。短小芽孢杆菌益生菌制剂的使用也明显改善了对虾的商品品质，增加了出肉率。此外，这个结果结合溶血实验也表明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) LV149具有生物安全性。本发明将对虾分为实验组和对照组，实验组对虾投喂添加有短小芽孢杆菌益生菌制剂的商品对虾饲料，对照组则只投喂商品对虾饲料。将对虾在含哈氏弧菌的水中浸泡24小时后，正常换水、投喂，观察对虾的摄食表现并统计死亡率，结果表明采用添加有短小芽孢杆菌益生菌制剂的饲料喂养对虾5天，对虾即表现出对哈氏弧菌具有一定的抵抗力，死亡率低于对照组；投喂10天、15天后，对虾死亡率明显低于对照组，投喂20天后，实验组的对虾的死亡率只有5%，由此表明在养殖应用中，短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) LV149可以抑制哈氏弧菌，坚持使用短小芽孢杆菌益生菌制剂10天以上，可以大大降低对虾弧菌病的患病率，长期使用基本可以杜绝弧菌病的发生。因此，本发明的第二个目的是提供短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149在制备抑制弧菌微生态制剂中的应用。所述的弧菌病原为哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、轮虫弧菌E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、创伤弧菌11758、 溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056和溶藻弧菌E066。本发明的第三个目的是提供一种短小芽孢杆菌益生菌制剂，其特征在于，以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为活性成份。本发明的第四个目的是提供一种短小芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为发酵菌株，经固态发酵，烘干粉碎后而制得。所述的短小芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其优选具体步骤为将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) LV149接种到LB培养基中培养制成种子培养液，再以5% 10%的接种量接种到固态发酵培养基中，发酵时间为20 48小时，发酵温度为30°C，发酵物于烘箱中50°C烘干，烘干物粉碎过60目筛，即为短小芽孢杆菌益生菌制剂，所述的固态发酵培养基由料和水组成，所述的料按总质量分数100%计，包括米糠5 20%、麸皮10 30%、 豆柏20 40%、玉米粉20 40%、脱脂奶粉I 5%、蔗糖I 5%、酵母提取物0. I 2%,NaCl 0. I 1%和饲用多矿0. I 0.5% (广州国信饲料科技有限公司，产品名称为 江丰多矿，货号为JC1000)，料水比为I : I I. 3。本发明的第五个目的是提供短小芽孢杆菌益生菌制剂作为饲料添加剂的应用。将本发明的短小芽孢杆菌益生菌制剂与对虾成品饲料按重量比0. I 1%的比例混合均匀， 吸附10 60分钟，即可投喂对虾，不仅可以抑制对虾肠道病原弧菌生长、减少对虾弧菌病的发生，同时促进对虾生长、降低饵料系数、提高商品品质、缩短养殖周期，从而减少养殖风险、降低养殖成本，且生物安全性高。所述的饲料优选为对虾饲料，进一步优选短小芽孢杆菌益生菌制剂按对虾饲料重量的0. I 1%添加。综上所述,本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149对弧菌具有广泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作为发酵菌株，经固态发酵、干燥粉碎制得以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为活性成分的短小芽孢杆菌益生菌制剂，将其添加到对虾饲料中，饲喂对虾，不仅可以起到抑制对虾肠道病原弧菌生长、减少对虾弧菌病的发生， 同时促进对虾生长、降低饵料系数、提高商品品质、缩短养殖周期，从而减少养殖风险、降低养殖成本，且生物安全性高，在水产养殖中具有广泛的应用前景。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M2011411。
图I是短小芽孢杆菌LV149三种酶活性检测图，其中I :淀粉酶活性；2 :脂肪酶活性；3 :蛋白酶活性；图2是短小芽孢杆菌LV149与短小芽孢杆菌LV479的RAPD分子指纹图谱比较。其中1，3，5，7，9，11，13分别为上海生工随机引物39，S10, Sll, S12，S13，S14，S15对短小芽孢杆菌LV149的RAH)扩增结果；2，4，6，8，10，12，14分别为上海生工随机引物59，510，511， S12，S13，S14，S15 对短小芽孢杆菌 LV479 的 RAI3D 扩增结果;M，DNA 分子 Marker DL 15000 ；图3是短小芽孢杆菌抑弧菌活性典型检测图。其中(I):短小芽孢杆菌LV448(指示菌)；(2):短小芽孢杆菌LV149 ;图4是短小芽孢杆菌LV149与对照细菌溶藻弧菌A056的溶血性检测图，其中(I) 短小芽孢杆菌LV149 ； (2):溶藻弧菌A056 (指示菌)。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用方法及技术， 如无特别说明，均为常规方法和技术。实施例I :短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149的筛选与分离(I)肠道粘附细菌分离分别于不同时间和不同市场购得健康凡纳滨对虾5批，每批30尾，从中挑取个体大、体色亮、光滑、无损伤、肝脏褐色的个体5尾，平均体长12cm。用体积分数75%的酒精消毒对虾体表，再用无菌海水冲洗，解剖后取其肠道于无菌锡箔纸上，用注射器吸取灭菌海水，迅速冲洗掉肠道内的粪便，每条肠道冲洗2-3次，以肉眼观察肠道内不残留内容物为止。于无菌匀浆器中加无菌生理盐水将肠道匀浆。取0.5mL匀浆液用无菌生理盐水(1% NaCl)按10倍系列稀释即为肠道粘附细菌悬液。将肠道粘附细菌悬液涂布对虾饲料培养基。对虾饲料培养基成分按总质量分数 100%计，包括对虾饲料打碎粉(过100目筛)10%，NaCl 1%，琼脂2%，其余为水，然后再灭菌倒平板。30°C培养24 48小时后，挑取菌落，进一步在LB培养基进行划线分离和纯化。总计获得对虾肠道粘附细菌500株。(2)三种酶活性肠道粘附细菌筛选按常规方法检测肠道粘附细菌的蛋白酶活性、脂肪酶活性、淀粉酶活性。结果发现 500株细菌中能同时产生三种胞外酶的菌株共有90株。(3)高酶活性肠道粘附细菌中筛选抑菌活性株采用平板滤纸片扩散法对上述获得的高酶活性肠道粘附细菌进行筛选，目的是获得具有抑制水产动物病原弧菌能力且高酶活性的菌株。所用培养基为LB培养基，指示菌为溶藻弧菌A056、哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154。受试菌与指示菌均事先用LB培养基过夜培养。将指示菌液采用灭菌1% NaCl适当稀释后涂布LB平板，LB平板上帖滤纸片，直径 5mm，每个滤纸片滴加受试菌液20ii L，30°C培养12-24小时，观察抑菌圈的出现，并测量抑菌圈的直径。结果表明90株具有高酶活性肠道粘附细菌中只有一株细菌LV149同时对三种弧菌具有抑制作用。(4)高酶活性肠道粘附细菌分子鉴定和生化鉴定从90株具酶活性的细菌中挑选生长较快、易于培养的69株细菌进行了基于 16S rRNA 基因的分子鉴定。PCR 扩增引物27F :5' -AGAGTT TGATC(C/A) TGG CTCAG-3'； 1492R:5' -TACGG(C/T)TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。阳性扩增片段直接递交 Invitrogen 公司纯化、测序。结果表明它们分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、利斯顿氏菌属(Listonella)和莫拉氏菌属(Moraxella)。其中数量最多是芽胞杆菌属，占鉴定细菌总数的53. 62%。细菌LV149的16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. I所示。经BLAST比对， 其与公布的多株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的16S rRNA基因一致度100%，与其它芽孢杆菌一致度为99%以下。因此，分子鉴定该细菌为短小芽孢杆菌。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)所列的方法对细菌进行常规的生理和生化鉴定。其与标准株的相似度为100%，属短小芽孢杆菌，此结果与分子鉴定的结果一致。因此该菌属于短小芽孢杆菌， 命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149，于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号=CCTCC NO :M2011411。尽管69株高酶活性肠道粘附细菌中有芽孢杆菌占多数，其中包括其它短小芽孢杆菌株，但只有一株短小芽孢杆菌LV149对三种弧菌有明显抑制作用。这表明在对肠道中， 具有高酶活性且具有抑制弧菌的芽孢杆菌株出现的比率非常低。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149的三种胞外酶均具有高的活性,三种酶活检测图见图I。(5)短小芽孢杆菌LV149的分子指纹图谱特征采用上海生工的随机扩增多态性DNA(RAPD)随机引物S9-S15分别对短小芽孢杆菌LV149和LV479进行了 RAPD扩增，以检测二者指纹图谱的差别。RAPD扩增程序93°C预变性 2min ；93°C lmin,36°C lmin,72°C 7min，共进行 35 个循环；最后 72°C延伸 7min。RAPD 产物以0. 8 %的琼脂糖电泳30min，紫外成像，结果见图2。由图2可见，采用的7条随机引物均能给出二株短小芽孢杆菌的指纹图谱，并且每条引物均能显示出二者明显的差别，这个结果表明LV149和LV479虽然属同一个种，但是遗传差异较大，导致其有不同的表型特征。 短小芽孢杆菌的RAPD指纹图谱可用于区分同种类的不同株，因此一定程度上可以防伪，并防止非法的产品剽窃。实施例2 :短小芽孢杆菌LV149的抑制弧菌谱分析及溶血性分析采用来自9个不同种的13株弧菌对短小芽孢杆菌LV149的抑制弧菌谱进行了分析。同样采用上述的平板滤纸片扩散法。根据抑菌圈的大小判定抑菌能力的强弱，抑菌谱分析结果见表I :表I :短小芽孢杆菌LV149的抑制弧菌活性分析
权利要求
1.短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)LV149，保藏编号CCTCC NO M2011411o
2.权利要求I所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) LV149在制备抑制弧菌微生态制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的弧菌为哈氏弧菌E385、副溶血弧菌 E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、轮虫弧菌E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、创伤弧菌11758、溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056或溶藻弧菌E066。
4.一种短小芽孢杆菌益生菌制剂，其特征在于，以权利要求I所述的短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)LV149 作为活性成份。
5.一种权利要求4所述的短小芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为发酵菌株，经固态发酵，烘干粉碎后而制得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为将短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)LV149接种到LB培养基中培养制成种子培养液，再以5% 10%的接种量接种到固态发酵培养基中，发酵时间为20 48小时，发酵温度为30°C，发酵物于烘箱中50°C烘干，烘干物粉碎过60目筛，即为短小芽孢杆菌益生菌制剂，所述的固态发酵培养基由料和水组成，所述的料按总质量分数100%计，包括米糠5 20%、麸皮10 30%、豆柏20 40%、玉米粉20 40%、脱脂奶粉I 5%、蔗糖I 5%、酵母提取物O. I 2%、 NaCl O. I 1%和饲用多矿O. I O. 5%，料水比为I : I L 3。
7.权利要求4所述的短小芽孢杆菌益生菌制剂作为饲料添加剂应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的饲料为对虾饲料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，短小芽孢杆菌益生菌制剂按对虾饲料重量的O. I 1%添加。
全文摘要
本发明公开了一种短小芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NOM2011411。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149具有强的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对弧菌具有广泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作为发酵菌株，经固态发酵、干燥粉碎制得以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为活性成分的短小芽孢杆菌益生菌制剂，将其添加到对虾饲料中，饲喂对虾，不仅可以起到抑制对虾肠道病原弧菌生长、减少对虾弧菌病的发生，同时促进对虾生长、降低饵料系数、提高商品品质、缩短养殖周期，从而减少养殖风险、降低养殖成本，且生物安全性高，在水产养殖中具有广泛的应用前景。
文档编号A23K1/16GK102586144SQ20121002920
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者任春华, 江海英, 王艳红, 罗鹏, 胡超群 申请人:中国科学院南海海洋研究所