专利名称：一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法及其应用。
背景技术：
南方水稻黑条矮缩病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)是一种由白背飞虱传播危害的病毒，水稻一旦发病，损失严重。SRBSDV自2001年首次在广东阳西县发现后，为害日趋严重。尤其90年代以后，杂交水稻种植面积的大幅度增加和吡虫啉的大范围高强度施用，使白背飞虱逐渐取代褐飞虱而成为优势种群，导致近年来我国南方大部分稻区白背飞虱连年暴发，2008年南方水稻黑条矮缩病毒病扩散至长江流域，2009年该病毒病在我国的发生面积约40万hm2，晚稻严重受害，超过O. 67万hm2水稻基本失收。2010年该病害在我国广西、广东、江西、湖南、福建、贵州、云南、浙江、安徽、海南等13个南部省份暴发成灾。2011年该病毒病仍在湖南、贵州、安徽、云南等多个南方省份发生流行。SRBSDV病毒粒体球状，直径70 75 nm。病毒基因组为双链RNA (dsRNA)，共10个片段，由大到小分别命名为SI S10，其中SlO编码病毒的外壳蛋白。水稻的各个生育期均可受到SRBSDV侵染，但不同生育期的稻株感病后表现症状有所不同初期感病的稻株明显矮缩，叶色深绿，上部叶的叶面可见凹凸不平的皱褶，拔节期地上数节节部有气生须根及高节位分枝，病株茎杆表面有乳白色大小约I 2 mm的瘤状突起，瘤突呈蜡点状纵向排列成一短条形，早期乳白色，后期褐黑色，不抽穗或仅抽包颈穗；分蘖期和拔节期感病稻株矮缩不明显、能抽穗，但穗型小、实粒少、粒重轻。南方水稻黑条矮缩病毒病的发生流行给我国的农业生产造成了严重的损失。南方水稻黑条矮缩病毒由白背飞虱介导传毒，病毒可在白背飞虱体内繁殖，白背飞虱一旦获毒，即终身带毒，若虫及成虫均能传毒，且白背飞虱高效传毒，水稻病株上扩繁的二代高龄若虫，可80%带毒。但该病毒不能经卵传播，植株间也不互相传毒。近年来我国南方水稻黑条矮缩病毒病发生处于上升时期，暴发态势仍将延续，应强化我国南方水稻黑条矮缩病的早期监测和预警，以单抗为核心建立的血清学方法是最经济、最有效的检测白背飞虱体内及水稻中SRBSDV的高通量的检测方法，因而筛选高灵敏度、高特异性的抗体尤为重要。此外筛选抗病品种是防治水稻病毒病最经济、最有效的方法。但由于该病依赖白背飞虱传播危害，且水稻毒源极难长期保存，使南方水稻黑条矮缩病的抗性品种选育受到 许大限制。本发明专利利用种植于温室或人工植物生长箱内的发病水稻或冷冻保存的感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻组织饲毒白背飞虱，获得携带SRBSDV的白背飞虱，用于抗SRBSDV单抗的筛选，并可用于接种水稻，在人工条件下快速鉴定抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻品种，为抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育和SRBSDV与媒介昆虫之间的互作等研究提供基础。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法及其应用。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法包括如下步骤
O白背飞虱的获得
从非南方水稻黑条矮缩病毒发生地区的水稻田间采集捕获白背飞虱若虫后在室内用非抗虫水稻品种的无毒稻苗饲养，待白背飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群，以后每代随机抽取种群中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法确定白 背飞虱不携带南方水稻黑条矮缩病毒，即获得不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱；2)白背飞虱的获毒
白背飞風从冷冻保存的水稻或玉米病株中获毒
饲毒前，白背飞虱在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；从-10°C至-80°C保存冰箱中取出冷冻保存的病株，放置温室或4°C冰箱中解冻I 3小时后移入烧杯内，每个烧杯放I 10株病株；接入20 300头I 2龄无毒的白背飞虱，烧杯用尼龙纱布封口 ；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 2天后将存活的白背飞虱移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期，约12 15天；用RT-PCR、dot-ELISA方法检测白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱；
或者，白背飞風从种植于温室或植物生长箱内的水稻或玉米病株上获毒
饲毒前，白背飞虱在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻或玉米病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放I 5株病株植物；每个装置中放入20 200头I 2龄无毒的白背飞虱，饲喂培养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒2 7天后将存活的白背飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约12 15天；用RT-PCR、dot-ELISA方法检测白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，用于筛选水稻的抗病品种，并为抗南方水稻黑条矮缩病毒抗病育种服务。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为将携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的I. 5-3叶期水稻苗，采用单苗5头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养2-7天后移出全部白背飞虱，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65%-75 %，光周期为16L 8D ;7天以后开始观察病毒症状，连续调查20-30天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻；根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于筛选抗南方水稻黑条矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及白背飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的免疫学方法。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于研究南方水稻黑条矮缩病毒与介体昆虫之间的互作及其传毒机理提供物质基础。本发明可以克服白背飞虱采用病株获毒方法中病株难以长期保存的技术瓶颈，拓宽了白背飞虱获毒及水稻品种抗性鉴定的时间，同时该发明专利使获得携毒白背飞虱不受季节、地方等条件的限制。携带SRBSDV 的白背飞虱可用于抗SRBSDV单抗的筛选，并可用于接种水稻，可人工条件下快速鉴定抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻品种，为抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育和SRBSDV与媒介昆虫之间的互作等研究提供基础。
图I RT-PCR方法检测水稻样品中SRBSDV的结果；
图2 Dot-ELISA方法检测水稻样品中SRBSDV的结果；
图3冷冻病叶饲喂白背飞虱获毒的装置 图4 dot-ELISA方法检测白背飞虱样品中SRBSDV的结果；
图5活的水稻病株饲喂白背飞虱获毒的装置 图6 RT-PCR方法检测获毒白背飞虱传毒能力的结果。
具体实施例方式本发明利用携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱可筛选抗SRBSDV的单抗，鉴定水稻品种对该病毒的抗性，为抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育提供手段和物质基础，还可为进一步研究SRBSDV与媒介昆虫之间的互作提供材料。白背飞虱的获得从非南方水稻黑条矮缩病毒发生地区的水稻田间采集捕获白背飞虱若虫后在室内用非抗虫水稻品种的无毒稻苗饲养，待白背飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群，以后每代随机抽取种群中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法确定白背飞虱不携带南方水稻黑条矮缩病毒，即获得不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱；
白背飞虱的获毒白背飞虱从冷冻保存的水稻或玉米病株中获毒饲毒前，白背飞虱在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；从-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷冻保存的病株，放置温室或4°C冰箱中解冻I 3小时后移入烧杯内，每个烧杯放I 10株病株；接入20 300头I 2龄无毒的白背飞虱，烧杯用尼龙纱布封口 ；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 2天后将存活的白背飞虱移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期，约12 15天；用RT-PCR、dot-ELISA方法检测白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱；
或者，白背飞風从种植于温室或植物生长箱内的水稻或玉米病株上获毒
饲毒前，白背飞虱在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻或玉米病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放I 5株病株植物；每个装置中放入20 200头I 2龄无毒的白背飞虱，饲喂培养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒2 7天后将存活的白背飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约12 15天；用RT-PCR、dot-ELISA方法检测白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，用于筛选水稻的抗病品种，并为抗南方水稻黑条矮缩病毒抗病育种服务。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗 性的方法为将携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的I. 5-3叶期水稻苗，采用单苗5头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养2-7天后移出全部白背飞虱，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65%-75 %，光周期为16L 8D ；7天以后开始观察病毒症状，连续调查20-30天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻；根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于筛选抗南方水稻黑条矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及白背飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的免疫学方法。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于研究南方水稻黑条矮缩病毒与介体昆虫之间的互作及其传毒机理提供物质基础。下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。I、感染SRBSDV水稻、玉米的获得
I)在SRBSDV发生水稻地区，根据感染SRBSDV水稻症状，采集感染SRBSDV水稻病叶，如2010年9月于福建福州采集感病水稻，并移栽于温室或人工培养箱或冻存于冰箱；2011年9月于云南施甸县南方水稻黑条矮缩病毒发生区采集具有严重矮化，高节位分蘖，叶浓绿皱缩，茎杆上有倒生根和白色蜡条，严重时蜡条为黑色，不抽穗或抽半包穗，谷粒空秕的水稻病样，并移栽于温室或人工培养箱或冻存于冰箱。也可以通过如下方法获得感染SRBSDV水稻2叶期以上的水稻植株在温室或人工植物生长箱中饲喂携带SRBSDV白背飞虱2-10天，使水稻感病。2) RT-PCR及基因测序方法检测水稻玉米是否带毒
参照Trizol试剂说明书提取水稻或玉米病样的总RNA,根据GenBank中报道的南方水稻黑条矮缩病毒的衣壳蛋白基因(CP基因)序列(登陆号EU784840)设计特异性引物，SRBSDV-CP-F (5，CGGGATCCATGGCTGACATAAGACTTGAC3，，划线部分为 BamHI 酶切位点)和SRBSDV-CP-R(5，CGGTCGACTCATCTGGTGACTTTATTTAAC3>，划线部分为 SalI 酶切位点)，并由上海英骏生物技术有限公司合成。采用RT-PCR方法检测水稻中的SRBSDV。反转录参照M-MLV反转录酶(Promega公司产品)说明书进行，PCR反应体系为即cDNA模板 μ ，5 XPrimeSTARTM Buffer (含 Mg2+) 10μ1，dNTP Mix 4μ1, PrimeSTARTM DNA Polymerase(2.5 U/μυθ. 5μ1，上下游引物各 μ ，最后双蒸无菌水补足反应终体积为50μ1。PCR反应体系如下预变性94°C 2 min,变性94°C 45 s，退火57°C 45 s，延伸72°C 90s，循环扩增35次，最后延伸72°C 10 min。扩增产物于O. 8%琼脂糖凝胶进行电泳分析结果如图I所示，水稻样品感染SRBSDV。并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参考试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加A与克隆载体pMD-18T vector连接，重组质粒命名为PMD18-T-CP，并转化到大肠杆菌DH 5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(AxyGEN)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体PMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar, NCBI-BLAST,所用的数据库为GeneBank等。基因测序确定水稻样品所带病毒为SRBSDV3) dot-ELISA检测水稻、玉米是否带毒
将水稻或玉米叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30 (w/v, g /mL)加入O. 01mol/L PBS(pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm离心3 min;取3 μ I上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温(10°C -35°C)干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ； NC膜放入1:5000倍稀释的抗RBSDV单抗中室温孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入1:8000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30 60 min; PBST 洗膜 4 5 次，每次 3 min; 66 μ L NBT 和 33 μ L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物缓冲液(O. I mol/L Tris C1、0. I mol/L NaCl、O. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。结果如图2所示，表明所测水稻感染RBSDV。检测后确定带SRBSDV的病株培养于温室或物质生长箱内或保存于-10 -80°C冰箱中。2、白背飞虱的获得
从非SRBSDV发生地区的水稻田间采集捕获的白背飞虱若虫，在室内用非抗虫水稻品种的无毒稻苗饲养(如日本晴、绝大多数目前生产上种植的水稻品种)，饲养温度为26-30°C，相对湿度为60 %-75 %，光周期为16L :8D。待白背飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法检测此虫带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并以其建立室内种群，以后每代随机抽取群体中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法确定其确实不带毒，即获得不带SRBSDV的白背飞虱，为避免传毒介体污染，每次饲毒前取100头白背飞風进行检测，确定其为无毒虫。I) dot-ELISA检测白背飞虱体内SRBSDV
单头白背飞風放入I. 5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 μ L PBS (0. Olmol/L，pH7. 4)，用牙签捣烂白背飞虱后、5000 rpm离心3 min，取3 μ L上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测水稻中SRBSDV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的白背飞虱作为阴性和阳性对照。检测结果表明白背飞虱没有携带 SRBSDV。2 ) RT-PCR方法检测白背飞虱体内SRBSDV
参照Trizol试剂说明书提取单头白背飞虱的总RNA，根据上述南方水稻黑条矮缩病毒的衣壳蛋白基因(CP基因)序列(登陆号EU784840)设计的特异性引物，采用上述检测水稻样品一样的RT-PCR方法检测白背飞虱体内是否有SRBSDV。
3、携带SRBSDV白背飞虱的获得
O白背飞虱从冷冻保存水稻或玉米病株中获毒
用滤纸保湿下1-2龄无毒的白背飞虱若虫饲毒前饥饿3小时；从-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷冻保存的病株，放置温室(10°C -35°C)或4°C冰箱中解冻，1-3小时后移入烧杯内(烧杯用尼龙纱布封口，既有较好的空气流动使白背飞虱存活，又可避免白背飞虱逃逸)(图3)，每个烧杯放1-10株病株，接入20-300头1-2龄无毒的白背飞虱若虫，饲毒前使其饥饿3小时。饲养温度为26-30°C，相对湿度为60 %-75 %，光周期为16L :8D。饲毒1_2天后将存活的白背飞虱移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26-30°C，相对湿度为60 %-75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期(约12-15天)，并记录存活的白背飞虱数量。并通过上述RT-PCR和dot-ELISA方法(图4)检测验证。饲喂后对250头白背飞虱进行RT-PCR和Dot-ELISA检测，冷冻叶片饲毒的白背飞虱平均带毒率为55%，这表明白背飞虱能从冷冻病叶上获得南方水稻黑条矮缩病毒。2)白背飞虱从种植于温室或植物生长箱内的水稻或玉米病株上获毒
用滤纸保湿下1-2龄无毒的白背飞虱若虫饲毒前饥饿3小时；经上述检测鉴定携带南方水稻黑条矮缩病毒的水稻或玉米病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制植物生长箱中培养，良好的空气流动确保植株与白背飞虱的存活，又避免白背飞虱的逃逸(图5)。每个塑料容器放1-5株病株植物。每个装置中放入饥饿3小时1-2龄无毒的白背飞虱20-200头。培养温度为26-30°C，相对湿度为60 %_75 %，光周期为16L :8D。饲毒2-7天后将存活的白背飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期(约12-15天)，并记录存活的白背飞虱数量。并通过上述RT-PCR、dot-ELISA等方法检测验证。接种后对移出的125白背飞虱进行RT-PCR和dot-ELISA检测，其带毒率为80%。这表明白背飞虱从培养的水稻病株上获得南方水稻黑条矮缩病毒的几率较高。4、获毒白背飞虱在单抗筛选工作中的应用
单头白背飞風放入I. 5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 μ L PBS (O. Olmol/L，pH7. 4)，用牙签捣烂白背飞虱后、5000 rpm离心3 min，取3 μ I上清点到NC上，同时设置健康和带毒白背飞虱分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ； NC膜放入适度稀释的杂交瘤细胞培养上清中室温孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次，每次3 min; NC膜放入适度稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30 60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min; A显色底物是HRP的显色底物，S卩如TMB沉淀型显色底物等。如果有阳性反应，则说明抗体可用于病毒的检测，从而以该单抗为核心建立合适的血清学方法对田间的水稻和白背飞虱进行检测，对SRBSDV的发生流行进行预测预警。5、获毒白背飞虱的传毒及水稻抗性鉴定
将上述从冷冻病叶和活的感病水稻植株上获毒的白背飞虱移入待鉴定的水稻苗(I. 5-3叶期)继续饲养2-7天，培养温度为26-30°C，相对湿度为60 %_75 %，光周期为16L 8D。采用单苗5头虫方法接种I. 5-3叶期的待鉴定水稻品种，每个品种选取50-100水稻苗鉴定，3-15天后移出全部白背飞虱，再将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65 %-75 %，光周期为16L :8D。7天以后开始观察症状，每天一次，连续调查20-30天。调查标准参照南方水稻黑条矮缩病的典型症状具有植株显著矮缩，高节位分蘖，叶浓绿皱缩，茎杆上有倒生根和白色蜡条，严重时蜡条为黑色等。并用上述RT-PCR和dot-ELISA方法检测接种后的水稻叶片，有典型症状的水稻均能扩增到目的条带，无发病症状的水稻均不能扩增到目的条带，这表明带毒白背飞虱将南方水稻黑条矮缩病毒接种至健康水稻品种上(图6)。同理，可根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻品种的抗性，即可用于人工条件下快速鉴定抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻品种，为抗南方水稻黑条矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育和SRBSDV与媒介昆虫之间的互作等研究提供基础。权利要求
1.一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法，其特征在于包括如下步骤 1)白背飞虱的获得 从非南方水稻黑条矮缩病毒发生地区的水稻田间采集捕获白背飞虱若虫后在室内用非抗虫水稻品种的无毒稻苗饲养，待白背飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群，以后每代随机抽取种群中10%的白背飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法确定白背飞虱不携带南方水稻黑条矮缩病毒，即获得不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱； 2)白背飞虱的获毒 白背飞風从冷冻保存的水稻或玉米病株中获毒 饲毒前，白背飞虱在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；从-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷冻保存的病株，放置温室或4°C冰箱中解冻I 3小时后移入烧杯内，每个烧杯放I 10株病株；接入20 300头I 2龄无毒的白背飞虱，烧杯用尼龙纱布封口 ；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 2天后将存活的白背飞虱移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期，约12 15天；用RT-PCR、dot-ELISA方法检测白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱； 或者，白背飞風从种植于温室或植物生长箱内的水稻或玉米病株上获毒 饲毒前，白背飞虱在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻或玉米病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放I 5株病株植物；每个装置中放入20 200头I 2龄无毒的白背飞虱，饲喂培养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒2 7天后将存活的白背飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约12 15天；用RT-PCR、dot-ELISA方法检测白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱。
2.一种如权利要求I所述方法获得的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的应用，其特征在于所述的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，用于筛选水稻的抗病品种，并为抗南方水稻黑条矮缩病毒抗病育种服务。
3.如权利要求2所述的一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的应用，其特征在于所述的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为将携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的I. 5-3叶期水稻苗，采用单苗5头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养2-7天后移出全部白背飞虱，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65%-75 %，光周期为16L 8D ；7天以后开始观察病毒症状，连续调查20-30天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻；根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性。
4.一种如权利要求I所述方法获得的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的应用，其特征在于所述的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于筛选抗南方水稻黑条矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及白背飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的免疫学方法。
5.一种如权利要求I所述方法获得的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的应用，其特征在于所述的携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱用于研究南方水稻黑条矮缩病毒与介体昆虫之间的互作及其传毒机理提供物质基础。
全文摘要
本发明公开了一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法及其应用。利用感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻或者冷冻保存的水稻病株饲喂白背飞虱，使白背飞虱获得SRBSDV，之后将带毒的白背飞虱转移至健康水稻上饲喂，直到渡过病毒的循回期，然后利用RT-PCR技术和血清学方法对白背飞虱进行检测，获得携带SRBSDV的白背飞虱，实验证明人工饲喂可使白背飞虱带毒率达50%以上。利用该发明获得的携带SRBSDV的白背飞虱可用于抗SRBSDV单抗的筛选，进行水稻接种实验鉴定水稻的抗性，筛选抗病品种，为抗病育种服务。本发明还可用于研究SRBSDV与媒介昆虫白背飞虱之间的互作关系，为更好的防治该病毒提供有力的理论依据。
文档编号A01G7/00GK102630640SQ20121005260
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者倪跃群, 刘欢, 吴建祥, 周文武, 周雪平, 徐毅, 祝增荣, 饶黎霞 申请人:浙江大学