专利名称：一种大豆高效遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及ー种大豆高效遗传转 化方法。
背景技术：
大豆[Glycine max (L)Merr.]是重要的经济作物和油料作物,它的遗传转化研究一直受到学者们的广泛关注，而主要瓶颈问题是转化效率低。现有的大豆遗传转化方法包括农杆菌介导法、电击法、PEG转化法、基因枪法、花粉管通道法等，比较成熟的是基因枪介导的体细胞胚转化法和农杆菌介导的子叶节转化法。1988年Christou等首次将基因枪法应用于大豆愈伤组织的遗传转化，但未获得再生植株，同年McCabe等利用基因枪法转化大豆芽分生组织，获得了转基因植株，但大都为嵌合体。此后，基因枪轰击法主要应用于大豆未成熟胚或体胚悬浮细胞系，能稳定获得转基因植株，但转化效率都较低，而且存在再生植株周期长和转基因植株败育等缺点。1998 年 Hinchee 等首次报告了根癌农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)介导法成功转化大豆的事例，后来不少学者采用这种方法进行大豆子叶节转化研究，都获得了转基因植株，但转化效率都比较低，而且嵌合体较多。
发明内容
本发明的目的是提供ー种大豆高效遗传转化方法。本发明提供了ー种大豆高效遗传转化方法，依次包括如下步骤(I)通过基因枪轰击法将含有目的DNA的质粒导入大豆外植体；(2)通过农杆菌介导法将所述含有目的DNA的质粒导入完成步骤⑴的大豆外植体。所述大豆外植体可为胚尖外植体，具体可为大豆成熟种子胚尖外植体(大豆萌动种子胚尖外植体)。所述大豆成熟种子胚尖外植体的制备方法依次包括如下步骤(I)将灭菌后的成熟大豆种子在无菌水中室温浸泡24小吋；(2)在无菌条件下去掉种皮，取下胚轴连同刚萌动的胚尖；(3)将下胚轴连同刚萌动的胚尖摆放在预培养培养基上，胚尖垂直向上，25°C_28°C培养24小时，然后去除原叶(叶原基，发育后形成真叶)，得到外植体(即大豆成熟种子胚尖外植体)；所述预培养的光照条件为16小时光照、光照強度150i!mOl HT2s-1,8小时黑暗。所述预培养培养基具体为含3. 5mg/L 6_苄氨基嘌呤和30g/L蔗糖的MS-B5固体
培养基。所述大豆具体可为K06-82大豆或科丰28号大豆。所述基因枪轰击法中，基因枪轰击的參数具体可为金粉直径大小为I. Oy m，真空度26 28英寸萊柱,氦气压カ为IIOOpsi,轰击距离为6cm,姆皿轰击2次(第一次轰击后平皿旋转90°再轰击第二次)，每次轰击I Ug所述含有目的DNA的质粒。具体可采用Bio-Rad PDSIOOO/He 基因枪。
所述农杆菌介导法具体可为将完成步骤(I)的大豆外植体在重组农杆菌菌悬液中28°C黑暗条件下振荡培养20小时；所述重组农杆菌是将所述含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到的重组农杆菌。所述农杆菌具体可为农杆菌GV3101。所述重组农杆菌菌悬液具体可为OD6tltlnm = 0. 45-0. 5的菌悬液。所述重组农杆菌菌悬液具体可通过如下方法制备将所述重组农杆菌重悬于培养基丁，得到重组农杆菌菌悬液。所述培养基丁为含6mg/L6-苄氨基嘌呤、200iiMこ酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS_B5液体培养基。こ酰丁香酮可以増加转染效率。以上任一所述方法均可用于制备转基因大豆。所述大豆具体可为K06-82大豆或科丰28号大豆。本发明还保护ー种制备转基因大豆的方法，依次包括如下步骤(I)将出发大豆进行以上任一所述的遗传转化；(II)依次进行共培养、恢复培养、筛选培养和生根培养，得到转基因大豆。 所述大豆具体可为K06-82大豆或科丰28号大豆。所述共培养具体可为在共培养培养基上，22°C暗培养4天。所述共培养培养基具体可为含 6mg/L 6-节氨基嘌呤、0. 154g/L ニ硫苏糖醇、0. 2g/L Na2S3O3^ lmg/L AgNO3Ug/LL-半胱氨酸、200 ii Mこ酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS_B5固体培养基。乙酰丁香酮可以增加转染效率。所述共培养培养基可以防止褐化和提高转化效率。所述恢复培养具体可为在恢复培养基上，250C _28°C培养6_7天(光照条件16小时光照、光照强度150 V- mo I m_2s_1,8小时黑暗)。所述恢复培养基具体可为含300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS-B5固体培养基。所述筛选培养可依次包括如下步骤①筛选培养基甲上，25°C _28°C培养14天(光照条件16小时光照、光照強度150 V- mo I ItT2S^S小时黑暗)；所述筛选培养基甲具体可为含0. 7mg/L草甘膦、300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS-B5固体培养基；②继代后转移到筛选培养基こ上，25°C _28°C培养14天(光照条件16小时光照、光照強度150i!mOl HT2s^S小时黑暗)；所述筛选培养基こ具体可为含0.8mg/L草甘膦、300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基；③继代后转移到筛选培养基丙上，25°C _28°C培养(光照条件16小时光照、光照強度150i!mOl HT2s^S小时黑暗)至芽长约3cm(14天左右)；所述筛选培养基丙具体可为含0. 9mg/L草甘膦、300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基。所述生根培养具体可为在生根培养基上25°C -28°C培养14_20天(光照条件16小时光照、光照強度150 u mol HT2s^S小时黑暗)，然后敞开瓶ロ练苗3-5天；所述生根培养基具体可为含300mg/L头孢霉素、0. lmg/L草甘膦和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基。本发明提供了ー种基因枪与农杆菌共同介导的大豆胚尖复合转化方法。本发明的方法中，先将含有目的基因的质粒通过基因枪对胚尖外植体的顶端分生组织进行轰击，该步骤不仅能导入ー些质粒，而且微弹轰击对大豆胚尖能造成众多微创伤，利于农杆菌侵染。微创伤能分泌ー种可溶性酚类化合物，此化合物可作为农杆菌感染的诱导信号，激活农杆菌增加侵染机会。然后，再用含有质粒的农杆菌侵染，又可将更多质粒导入受体组织中，这样的复合转化能够大幅度提高转化效率。再经过共培养、恢复培养、筛选培养及生根培养等环节，可以高效得到转基因植株。本发明提供的方法能在一定程度上解决长期困扰大豆遗传转化中过分依赖受体基因型和转化效率低的难题，不仅为其他不易转化的作物进行遗传转化提供了借鉴，也为大豆分子生物学和基因工程育种等研究提供了有力工具。本发明还具有取材方便、周期短、简便易行等优点，必将为推动大豆基因工程育种的发展奠定基础。
图I为实施例I的复合遗传转化整个流程中各步骤的照片。图2为实施例I中PCR鉴定bar基因的結果。图3为实施例I中PCR鉴定gus基因的結果。 图4为实施例I中⑶S染色的結果。图5为实施例I中用bar基因检测试纸条鉴定PAT蛋白的結果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。转化率转基因植株数量占基因枪轰击和/或农杆菌侵染胚尖外植体总数的百分率。K06-82(即科豆2号)大豆安徽同丰种业有限公司。科丰28号大豆安徽同丰种业有限公司。双元载体pCAMBIA3301 (又称pCAMBIA3301质粒):TRANSGEN公司；双元载体PCAMBIA3301含有bar基因(编码PAT蛋白)和gus基因(编码⑶S蛋白)。农杆菌GV3101 购自TRANSGEN公司。1/2MS-B5液体培养基的制备方法取1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐和B5有机元素，溶于水并定容至1し1/2MS-B5固体培养基在1/2MS_B5液体培养基的基础上，每升添加2g植物凝胶(购自 Sigma，货号 P8169)。MS-B5固体培养基的制备方法取MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐以及B5有机元素，溶于水并定容至1しMS大量元素硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸ニ氢钾170mg/L、七水硫酸镁370mg/L和ニ水氯化钙440mg/L。1/2MS大量元素MS大量元素各组分的浓度均减半。MS微量元素碘化钾0. 83mg/L、硼酸6. 2mg/L、硫酸镁22. 3mg/L、硫酸锌8. 6mg/L、钥酸钠0. 25mg/L、五水硫酸铜0. 025mg/L和六水氯化钴0. 025mg/L。MS铁盐こニ胺四こ酸ニ钠37. 3mg/L和七水硫酸亚铁27. 8mg/L。B5有机元素盐酸硫胺素(维生素BI) 10mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6) lmg/L、烟酸 lmg/L 和肌醇 100mg/L。实施例I、K06-82大豆的复合遗传转化一、外植体的获得I、灭菌
取表面光滑无病斑的K06-82大豆饱满成熟种子，在密闭容器(含氯气)中放置16小吋。2、浸泡取完成步骤I的大豆，在无菌水中室温浸泡24小时。3、取完成步骤2的大豆，在超净工作台上去掉种皮，将下胚轴连同刚萌动的胚尖与两片子叶剥离，取下胚轴连同刚萌动的胚尖。
4、将步骤3获得的下胚轴连同刚萌动的胚尖摆放在预培养培养基上，胚尖垂直向上，见图1A，25°C培养24小时(光照条件16小时光照、光照强度150 ii mol m^2s^,8小时黑暗)，然后去除原叶，得到外植体。预培养培养基含3. 5mg/L 6_苄氨基嘌呤(6-BA)和30g/L蔗糖的MS-B5固体培养基。ニ、基因枪轰击I、将完成步骤ー的外植体摆放在新的预培养培养基上，密集摆放成直径约2. 5cm圆形，见图IB02、基因枪轰击在超净工作台上将完成步骤I的培养皿进行基因枪轰击，按照Bio-Rad PDS1000/He基因枪使用说明书进行。基因枪轰击的參数金粉直径大小为I. Oii m，真空度26 28英寸萊柱，氦气压カ为IlOOpsi,轰击距离为6cm,姆皿轰击2次(第一次轰击后平皿旋转90°再轰击第二次)，姆次轰击lug pCAMBIA3301质粒。三、农杆菌侵染I、将pCAMBIA3301质粒导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。2、将步骤I的重组农杆菌重悬于培养基丁，使OD6tltol = 0. 45-0. 5，即为重组农杆菌菌悬液。培养基丁 含6mg/L 6_苄氨基嘌呤、200 y Mこ酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B5液体培养基。3、将完成步骤ニ的外植体置于步骤2的重组农杆菌菌悬液中(见图1C)，28°C黑暗条件下振荡培养20小吋。四、共培养取完成步骤三的外植体，用无菌滤纸吸干菌液，然后转移到共培养培养基，220C暗培养4天，见图1D。共培养培养基含6mg/L 6_苄氨基嘌呤、0. 154g/L ニ硫苏糖醇、0. 2g/L Na2S3O3,lmg/L AgNO3> Ig/L L-半胱氨酸、200 u Mこ酰丁香酮、30g/L鹿糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B5固体培养基。共培养后的外植体的⑶S染色图见图4A，胚尖显示为蓝色，即表达了⑶S蛋白。五、恢复培养取完成步骤四的外植体，用无菌水洗浄，然后转移到恢复培养基中，25°C -28°C培养6-7天(光照条件16小时光照、光照强度150 ii mol IrT2s'8小时黑暗)，见图1E。恢复培养基含300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基。六、筛选培养
I、取完成步骤五的外植体，转移到筛选培养基甲，25°C _28°C培养14天(光照条件16小时光照、光照强度150 ii mol HT2s^S小时黑暗)，见图1F。
筛选培养基甲含0. 7mg/L草甘膦、300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基。2、将完成步骤I的外植体继代，转移到筛选培养基こ，25°C _28°C培养14天(光照条件16小时光照、光照强度150 u mol HT2s^S小时黑暗)。筛选培养基こ含0. 8mg/L草甘膦、300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基。3、将完成步骤2的外植体继代，转移到筛选培养基丙，25°C _28°C培养(光照条件16小时光照、光照强度150 ii mol IrT2S^S小时黑暗)至芽长约3cm (14天左右)。筛选培养基丙含0. 9mg/L草甘膦、300mg/L头孢霉素和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体培养基。芽的⑶S染色结果见图4B。可以观察到表达了⑶S蛋白。七、生根培养切下步骤六的芽，转移到生根培养基(见图1G)，25°C -28°C培养14_20天(光照条件16小时光照、光照强度150 ii mol HT2s^S小时黑暗)，见图IH (根长到足够健壮)，然后时敞开瓶ロ练苗3-5天(见图II)。生根培养基含300mg/L头孢霉素、0. lmg/L草甘膦和30g/L蔗糖的1/2MS_B5固体
培养基。ノV、获得转基因植株将完成步骤七的苗转移至营养土，温室中正常培养(温度25°C -28 °C,自然光照)，温室培养14天的照片见图1J。九、转基因植株的鉴定取温室培养14天的植株叶片，分别进行如下鉴定I、提取基因组DNA，用Fl和Rl组成的引物对PCR鉴定bar基因。Fl (序列表的序列 I) :5’ -GCACCATCGTCAACCACTAC-3’ ；Rl (序列表的序列 2) :5’ -TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’。Fl和Rl的靶序列为约440bp的bar基因片段。鉴定结果见图2。图2中肩为1&^1 ^，1为正对照(双元载体？041^从3301)，2为负对照(未进行遗传转化的K06-82大豆)，3为空白对照(水)，4至17为进行遗传转化后得到的植株)；箭头标注目的片段。2、提取基因组DNA，用F2和R2组成的引物对PCR鉴定CaMV35S启动子和gus基因。F2 :5， -AAGGAAGGTGGCTCCTACAA-3，；R2 :5 ’ -AATATCTGCATCGGCGAACT-3，。F2和R2的靶序列为约669bp的CaMV35S启动子和⑶S基因片段。鉴定结果见图3。图3中肩为1&^1 ^，1为正对照(双元载体？041^从3301)，2为负对照(未进行遗传转化的K06-82大豆)，3为空白对照(水)，4至17为进行遗传转化后得到的植株)；箭头标注目的片段。
3、⑶S 染色。结果见图4C，显示蓝色斑点，即表达了⑶S蛋白。4、提取总蛋白，用bar基因检测试纸条(购自EnviroLogix,货号AS013LS)鉴定PAT蛋白，结果见图5。图5中，I为正对照(PAT蛋白)，2为负对照(水)，3为未进行遗传转化的K06-82大豆，4为进行遗传转化后得到的植株)。如果待测植株步骤I和步骤2均鉴定为阳性，则待测植株为遗传转化成功的转基因植株。步骤3和步骤4仅为抽样验证，且阳性判断结果均与步骤I和步骤2 —致。进行三次重复试验，转化率分别高达21. 68 %、24. 15%和20. 88%，平均值为22. 24%±1. 70%。对比例I、基因枪轰击法转化对比例除了中间跳过步骤三，其它均同实施例I。三次试验的平均转化率为8. 78% ±1.22%。对比例2、农杆菌介导法转化对比例除了中间跳过步骤ニ，其它均同实施例I。三次试验的平均转化率为7. 94% ±1.27%。实施例2、科丰28号大豆的遗传转化用科丰28号大豆代替K06-82大豆,其它同实施例I。三次试验的平均转化率为18. 48% ±1. 50%。对比例3、基因枪轰击法转化对比例除了中间跳过步骤三，其它均同实施例2。三次试验的平均转化率为13. 86% ±1.31%。对比例4、农杆菌介导法转化对比例 除了中间跳过步骤ニ，其它均同实施例2。三次试验的平均转化率为9. 78% ±1.25%。
权利要求
1.ー种大豆转化方法，依次包括如下步骤 (1)通过基因枪轰击法将含有目的DNA的质粒导入大豆外植体； (2)通过农杆菌介导法将所述含有目的DNA的质粒导入完成步骤(I)的大豆外植体。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述外植体为胚尖外植体，具体为萌动种子胚尖外植体。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述大豆为K06-82大豆或科丰28号大豆。
4.权利要求I至3中任一所述方法在制备转基因大豆中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述大豆为K06-82大豆或科丰28号大豆。
6.ー种制备转基因大豆的方法，依次包括如下步骤 (I)将出发大豆进行权利要求I至3中任一所述的转化； (II)依次进行共培养、恢复培养、筛选培养和生根培养，得到转基因大豆。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述大豆为K06-8大豆2或科丰28号大豆。
全文摘要
本发明公开了一种大豆高效遗传转化方法。本发明提供的方法，依次包括如下步骤(1)通过基因枪轰击法将含有目的DNA的质粒导入大豆外植体；(2)通过农杆菌介导法将所述含有目的DNA的质粒导入完成步骤(1)的大豆外植体。所述外植体可为胚尖外植体。本发明还保护一种制备转基因大豆的方法，依次包括如下步骤(I)将出发大豆进行以上任一所述的转化；(II)依次进行共培养、恢复培养、筛选培养和生根培养，得到转基因大豆。本发明提供的方法能够克服大豆遗传转化效率低的难题，为大豆分子生物学和基因工程育种等研究提供有力工具。本发明还具有取材方便、周期短、简便易行等优点，必将为推动大豆基因工程育种的发展奠定基础。
文档编号A01H5/00GK102618573SQ20121008546
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者周国安, 朱保葛, 李素坤, 杨瑞, 潘毅 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所