专利名称：一种含LoxP-FRT重组酶位点的植物双元表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种含LoxP-FRT重组酶位点的植物双元表达载体。
背景技术：
随着技术的发展，新的植物遗传转化方法在不断增加。但在众多的植物遗传转化方法中，对农杆菌介导的转化方法研究的最多，机理最为透彻。农杆菌介导的转化因操作简单、费用低廉等独特优点，成为植物遗传转化的首选。根癌农杆菌介导的方法是获得稳定的植物遗传转化的方法之一。 根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，是植物病原菌，可以引发植物产生冠瘿瘤。农杆菌能够通过感染植物的伤口，将其Ti质粒的T-DNA区整合到植物基因组中。这是自然界中将外源DNA转入植物细胞的天然方法。Ti质粒T-DNA区段的左右两端各有一个高度保守的25bp长的同向不完全重复序列(LB和RB)。在农杆菌对植物的转化中RB先进入植物细胞，随后外源基因及LB进入。原始的农杆菌T-DNA上编码的部分基因可以破坏植物细胞内源激素的平衡，干扰植物正常新陈代谢，引发植物肿瘤的形成。T-DNA的切除和转移是由Ti质粒的致毒(Vir)区基因编码的蛋白完成。在所有的Ti质粒中，T-DNA区和Vir区是两个不同的区域。这是农杆菌介导植物转化的基础。人们利用农杆菌转化的原理，开发了植物表达双元载体系统。一个双元载体系统是由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒组成。通常实验中构建的双元载体为已去除了 T-DNA中与干扰植物新陈代谢相关的基因，只含有T-DNA的两端边界序列。辅助质粒为含有Vir区段，但T-DNA缺失，完全丧失了致瘤的功能；其作用是提供Vir基因功能，激活T-DNA转移。为了使双元Ti载体能够穿梭在大肠杆菌和农杆菌中，并能自我复制，在这些质粒中常用到广谱复制原点，如PBIN19及其Ti质粒用到的pRK2。双元Ti质粒也可有两个复制原点(oris) JnpCGN系列质粒,一个用于大肠杆菌(如来自pColEl),另一个用于农杆菌(如来自pRi)。早期双元载体pBIN19等的T-DNA区常克隆自野生型Ti质粒(如pTiT37)。后来人们才人工合成了 25bp重复结构的LB和RB片段。LB和RB之间序列常为一个选择标记基因(编码抗生素或除草剂)表达框和一些多克隆位点(MCS)。有的还含有一个用于蓝白斑筛选的缺陷型￠-半乳糖苷酶基因(LacZ)。早期尽管人们已对Ti载体进行修改，但载体通常都很大(超过10kb)，MCS位点少，且在大肠杆菌中拷贝数很低。离体的重组效率与质粒DNA的大小成反比。为了能满足转化大片段DNA的需要，双元Ti载体应尽量最小化。随着人们对双元载体的不断改进，这些缺陷正逐渐减少。随着人们对转基因植物的生物安全性意识的提高，无标记转基因植物成为商业生产转基因植物发展的热点。国内外研究者陆续开发了多种有效的策略。利用Cre或Flp重组酶，在获得转基因植株后将选择标记基因去除是研究最为详细、应用最广的技术之一。虽然这些策略在删除标记基因上取得了成功，但在载体的构建过程中由于经过多次的亚克隆步骤，最终能用于目的基因工程操作的MCS变得非常稀少，妨碍了后期的基因工程操作。现在常用的植物转化双元载体(如pGreen、pCAMBIA等系列)虽然有着诸多的优点，方便基因工程操作，但其主要是为基础研究所创造，没有为后期将植物筛选标记去除做准备。这就使其在植物遗传转化商业生产应用中受到限制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种载体。本发明提供的载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌复制起始原点ColEl、农杆菌复制起始原点Rep-ori、调节蛋白Rep表达框、T-DNA超驱动区、T-DNA右边界、T-DNA左边界和Kan抗性基因表达框。上述载体中，所述大肠杆菌复制起始原点ColEl为序列表中序列4自5’末端第 1-589位核苷酸所不的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第1-589位核苷酸所不的双链DNA片段；所述农杆菌复制起始原点Rep-ori为序列表中序列4自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；所述调节蛋白Rep表达框为序列表中序列4自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；所述Kan抗性基因表达框为序列表中序列4自5’末端第2448-3694位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第4120-5366位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第4351-5597位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第3877-5123位核苷酸所示的双链DNA片段；其蛋白的表达与质粒5’-3’顺序相反；所述T-DNA超驱动区为序列表中序列4自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；所述T-DNA左边界为序列表中序列4自5’末端第2423-2447位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第4095-4119位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第4326-4350位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第3852-3876位核苷酸所示的双链DNA片段；所述T-DNA右边界为序列表序列4自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段，也为序列表中序列I自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段。
上述载体中，在所述T-DNA右边界和所述T-DNA左边界之间还包括内酶切识别位点I ;所述内酶切识别位点I具体为MluI的识别位点。上述载体中，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列4。上述载体中，在所述T-DNA右边界和所述T-DNA左边界之间还包括含有植物筛选标记基因表达框的片段，所述含有植物筛选标记基因表达框的片段自5’末端至3’末端依次包括多克隆酶切识别位点、右侧LoxP-FRT融合位点、植物筛选标记基因表达框和左侧LoxP-FRT融合位点。上述载体中，所述多克隆酶切识别位点为22个内切酶识别位点，所述22个内切酶识别位点自5’末端至3’末端具体依次为DraI识别位点、PmeI识别位点、NruI识别位点、识别位点甲、识别位点乙、Eco0109I识别位点、XhoI识别位点、PspXI识别位点、SalI识别 位点、ClaI识别位点、HindIII识别位点、EcoRV识别位点、EcoRI识别位点、PstI识别位点、识别位点丙、BamHI识别位点、SpeI识别位点、NotI识别位点、AleI识别位点、SacI识别位点、Mfe I识别位点、Age I识别位点；所述识别位点甲为KpnI位点或Acc65I识别位点；所述识别位点乙为ApaI位点或PspOMI识别位点；所述识别位点丙为SmaI位点或XmaI的识别位点；所述植物筛选标记基因表达框为NptII基因表达框、Hyg基因表达框或Bar基因表达框。上述植物筛选标记基因表达框的蛋白表达与质粒5’ -3’顺序相反。上述载体中，所述左侧LoxP-FRT融合位点为序列表中序列I自5’末端第4016-4083位核苷酸所示的双链DNA片段或序列2的自5’末端第4247-4314位所示的双链DNA片段或序列3的自5’末端第3773-3840位核苷酸所示的双链DNA片段；所述右侧LoxP-FRT融合位点为序列表中序列I自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段或序列2的自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段或序列3的自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段；所述NptII基因表达框为序列表中序列I自5’末端第2650-4007位核苷酸所示的双链DNA片段；所述Hyg基因表达框为序列表中序列2自5’末端第2650-4238位所示的双链DNA片段；所述Bar基因表达框为序列表中序列3自5’末端第2650-3764位所示的双链DNA片段。上述载体中，在所述左侧LoxP-FRT融合位点和所述T-DNA左边界之间还包括内切酶识别位点2 ;所述内切酶识别位点2具体为PmlI识别位点；在所述左侧LoxP-FRT融合位点和所述筛选标记基因表达框之间还包括内切酶识别位点3 ;所述内切酶识别位点3具体为AscI识别位点；在所述植物筛选标记基因表达框和所述右侧LoxP-FRT融合位点之间还包括由多个内切酶识别位点组成内切酶识别位点组；所述内切酶识别位点组自5’末端至3’末端具体依次为BsiWI识别序列、StuI识别序列和AseI识别序列。
所述载体自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌复制起始原点ColEl、农杆菌复制起始原点R印-ori、调节蛋白R印表达框、T-DNA超驱动区、T-DNA右边界、多克隆酶切识别位点、右侧LoxP-FRT融合位点、BsiWI识别序列、StuI识别序列、AseI识别序列、植物筛选标记基因表达框、AscI识别位点、左侧LoxP-FRT融合位点、PmlI识别位点、T-DNA左边界和Kan抗性基因表达框。上述载体为如下I)或2)或3):I)所述载体中植物筛选标记基因为NptII基因，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列I ;2)所述载体中植物筛选标记基因为Hyg基因，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 3)所述载体中植物筛选标记基因为Bar基因，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列3。上述的载体在培育转基因植物中的应用。本发明的实验证明，本发明构建了植物表达双元载体pYBAlOO、pYBA200和PYBA300，其载体较小且在T-DNA区获得较多的22个MCS位点，由于使用了大肠杆菌复制原点ColEl和农杆菌复制起始原点R印_ori，可在大肠杆菌和农杆菌中复制，且具有较高的复制能力，方便了基因工程操作。载体的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点，方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除，可以满足用于安全生产转基因植物的需要。
图I为pYBA载体骨架结构示意2为大肠杆菌中提取的不同质粒DNA浓度比较图3为载体pYBAlOO结构示意4为载体pYBA200结构示意5为载体pYBA300结构示意6为pYBAlOO转基因植株T-DNA区段的PCR检测图7为pYBA200转基因植株T-DNA区段的PCR检测图8为pYBA300转基因植株T-DNA区段的PCR检测图9为pYBAlOO质粒经Cre重组酶离体删除选择标记基因图10为pYBA200质粒经Cre重组酶离体删除选择标记基因
图11为pYBA300质粒经Cre重组酶离体删除选择标记基因
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、植物表达双元载体pYBAlOO、pYBA200、pYBA300的构建野生型拟南芥Columbia (Col-O)购自 ABRC(Arabidopsis BiologicalResourceCenter, Columbus, OH, USA)，产品目录号为CS28166，实施例中简称为野生型拟南芥;大肠杆菌菌株DH5a购自Tiangen公司，产品目录号为CBlOl ;根癌农杆菌GV3101(pMP90)公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献Koncz, C. and Schell, J. (1986)The promoter of TL-DNA gene 5 controlsthe tissue-specifice xpression of chimeric genes carried by a novel type ofAgrobacterium binary vector. Mol. Gen. Genet. 204, 383 - 396。pBBBasta载体的构建方法如下1、用SacI酶切质粒pDHB321. 1，回收约2100bp的片段(含LB-bar表达框-RB，序列5)。2、用SspI酶切质粒pBBRlMCS_2，回收约4440bp的片段(含卡那霉素抗性基因的骨架)。3、将步骤I回收的约2100bp的片段补平，与步骤2回收的约4440bp的片段连接，获得植物表达载体pBBBasta，pBBBasta为将序列5插入pBBRlMCS_2的)SspI酶切位点间得到的载体。pBBRlMCS-2公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献=BlockMD, BottermanJ, Vandewiele M,Dockx J, Thoen C, GosseleV, Movva NR, ThompsonC，Montagu MV, LeemansJ. Engineering herbicide resistance in plants by expressionof a detoxifying enzyme. EMBO J. 1987 Sep;6(9):2513-8.pBI121 载体购自 ABRC,目录编号:CD3_388 ；pBluescript II KS(+)载体购自Agilent公司(目录编号212207);pUC19载体购自NEB公司(目录编号N3041 )；pGreen0029载体购自 John Innes Centre (http://www. pgreen. ac. uk/) ;pCAMBIA1300 载体公众可以从 http://www. cambia. org/ 获得；本实验使用的各种限制性内切酶购自TaKaRa和NEB公司，Cre重组酶、T4连接酶、去憐酸化酶购自 NEB 公司，Easy Taq 和 TransStart FastPfu DNA Polymerase 购自TransGen Biotech公司。PCR纯化试剂盒,胶回收试剂盒,质粒小提试剂盒都购自康为世纪有限公司。引物、DNA合成及测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。本实验使用引物的核苷酸序列如下表I所示表I试验中所用引物......丽................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
KaiiS，5, - CCGACGCGTamacaccacaataialcctgccaCGATTTGCCCATGGGGGl-3
Kan3f54 -gcggagcciaiggaaaCTGGGATGAATGTCAGCTACTG-3 *
colES"5 * -giagctgacaitcaicccagTTTCCATAGGCTCCGCCC-3 *
colE3，5f -tagtgagtatactcaagcIIGAGATCCITITTITCTGCGCGTAATCTG-3! Ori-rep5￥5，-acgcgcagaaaaaaaggatclcaaGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTG-3，
Ori-rcp3"5 ’ -actaagtcgclgtaigtgiltglUgIATTCTGCCTCCCAGAGCCT-3 ’
RB3 ’5 -CCGAC MtgacaggatataUggcgggiaaacTAAGTCGCTGTATGlGITTG-31
PsfIS'5 ’ -CCCTGAATGAACTtCAGGACGAGGCAGCGCGG-3，
PsiO'5 ’ -CCGCGCTG€CTCGTCCTGaAGTTCATTCACiGCi-3,
MCS515 ’ -GCGCTaccggtCTATAGGGCCAMICGAGCTCCAC-3
MCS315，~AGCTTTMmmctcQcmGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTC~3f
NosPS，5，-TTGGCGC(HrCflaicatgagcggagaattaa￡gaagl-3
NosP3!5 * -aatccatctigiicaatcatAGATCCGGTGCAGATTATTTG-34
NptII5，5，-aiaatcigcaccggalctATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-3 ’
NptIO *5 ’ -tgccaaatglttgaacgalcTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3
NosTS!5，-citcltgacgagilctlctgaGATCGTTCAAACATTTGGCA-3
Nosl'3 *5 * -CCAl IAAFcccgatctagtaacafaeatgacac-3"
ICpnLr5’-CTTCAGCCTGCCGGTCCGCCCCGTC-3’
Kpif3，y-GACGGGGCGGaACCGGCAGGCTGAAG-3'
SalIS!5、CTACGACTGGACGGC€GAGTCtACCGTGTACGTCWCd
SalLV5^GGGAGACGTACACGGTaGACTCGGCCGTCCAGTCGTAG-3
Agd5，5，-GCTGTTCTACAA(X:aGT(GCGGAGGCTATG-3’
Agcl3 S^-CATAGCCTCCGCGACtGGTTGTAGAACAGC-S'
Apal5，S^CGCCTACGCiGGCCCCTGG
ApaLVS^CCAGGGGCCaGCGTAGGCG
Hyg NosP3555 gigagiicaggciiiiicatAGATCCGGTGCACATTATTTG
HygfT5 ^caaalaalclgcaccggalctAfGAAAAAOCC IGAACrCACCGC-Jl
Hyg.r3’4geeaaatgmgaacgatdTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGirG-3’
Hyg-NmIT.I^giccgagggcaaagaaaiagGATrGTTC AAAC ATTTGGrA-35
NosT3'S'-CCAJTAATcccgatciagiaacaiagaigacac-J1
NosPS'5\TTe￡￡em￡Cgaieatgageggagaaimggg_-3’
Bar-NosP355 ^gcglcgttclgggctcatAG ATCCyGTCC^^GATTAT^FGGATTG-3,
Bar ’.I'-caaaiaalclgcaccggalciATGAGCCCAGAACGACGCo'
Bar.V.l^itgccaaalgmgaacgatcTCAGATCTCGGTGACGGGCAGCi.r
Bm-NosT5s5MgoxgtcaccgagaicigaGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGT-3’注各融合片段之间相邻部分的引物为部分反向互补序列。一、pYBA双元载体骨架的构建DNA操作和克隆都基于分子克隆手册所述方法。PCR产物纯化，DNA片段回收及质粒小量提取操作均按照试剂盒厂家提供使用说明书操作。为了能使构建的载体最小化，新设计的pYBA载体骨架部分尽量去除了非必要的元件(该载体的结果示意图如图I)。PYBA骨架自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌复制起始原点ColEl、农杆菌复制起始原点Rep-ori、调节蛋白Rep表达框、T-DNA超驱动区(overdrive, OD)、T-DNA右边界(RB)、MluI的识别位点、T-DNA左边界(LB)和Kan抗性基因表达框，约3. 69kb。该载体骨架在LB和RB间留有I个MluI位点，用于后期LB至RB间序列的插入；为了尽可能保留多的单酶切位点用于MCS，pYBA载体骨架采用融合PCR方法构建。
具体构建方法如下I、载体骨架元件的获得I)突变前Kan抗性基因表达框的获得以pBBBasta载体为模板，用引物Kan5’和Kan3’扩增，结果获得1297bp的突变前Kan抗性基因表达框片段(经过测序为序列表中序列4的自5’末端第2417-3694、1-16位核苷酸，且第3249位点为C，且第3246 — 3251为PstI位点)。其中LB设计在引物Kan5’中，其中小写部分为LB序列，下划线部分是MluI限制性内酶切位点。
2) ColEl片段的获得以pUC19载体为模板，用引物colE5，和引物colE3，扩增，得到627bp的ColEl片段(经过测序为序列表中序列4的自5’末端第3675-3694、1-611位核苷酸)。3)ori_RB片段的获得以pBBBasta载体为模板，用引物0ri_rep5’和0ri_rep3’扩增，得到1824bp的ori-Rep片段(经过测序为序列表中序列4的自5’末端第566-2393位核苷酸)；再以ori-Rep片段为模板，用引物0ri_rep5’和引物RB3’延伸扩增，获得1856bp的ori-RB片段(经过测序为序列表中序列4的自5’末端第566-2422位核苷酸)。RB设计在引物RB3’中，其中小写部分为RB序列，下划线部分是MluI限制性内酶切位点，大写部分为OD序列。为了后期PCR产物的融合，引物colE5’和Kan3’为部分反向互补，引物colE3’和0ri-rep5’为部分反向互补。上述PCR产物均经琼脂糖凝胶电泳去除多余引物后，切胶回收后备用。2、中间载体I的获得I) Kan 和 ColEl 片段融合以上述I得到的突变前Kan抗性基因表达框和ColEl片段为模板，用引物kan5’和引物colE3’进行融合PCR，得到大小为I. 89kb的Kan-ColEl融合片段(经过测序为序列表中序列4的自5，末端第2417-3694、1-611位核苷酸)。上述融合PCR 反应体系为5x FastPfu Buffer IOu I, 2. 5mM dNTPs5u I, FastPfu DNAPolymerase I U I, Kan 和 ColEl 纯化后的 PCR 产物各 I ii 1，加水至47. I。上述融合PCR 的反应条件为95°C 2min，(95°C 20s，55°C 20s，72°C lmin)x48 循环，72°C 5min ;前12个循环不加引物，在第13个循环时加入引物kan5’和colE3’各I. 2 yl。2)中间载体的获得用MluI和HindIII分别双酶切上述I)得到的Kan-ColEl融合片段和上述I得到的ori-RB片段，酶切产物用T4连接酶4°C过夜连接后，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5a，获得转化子。将转化子提取质粒进行PCR，引物为Kan5’和Kan3’，得到1297bp的片段为PCR阳性质粒。再将上述PCR阳性质粒分别用HindIII和BglII酶切，得到3690bp的片段即为中间载体。3、pYBA双元载体骨架的构建
I)去除HindIII酶切位点将上述2得到的中间载体用HindIII酶切后得到酶切产物,再用Klenow Fragment补平所述酶切产物末端得到平末端产物，最后将所述平末端产物自连，获得去除HindIII酶切位点的载体(图I所示的HindIir位置为去除HindIII的位置)。2)去除PstI酶切位点新载体的抗性基因Kan中含PstI酶切位点。为了消除该位点对后期MCS的影响，采用定点突变的办法将该位点去除。突变原则是选用单双子叶植物偏好兼并密码子，在不改变Kan氨基酸序列的情况下，改变核酸序列(序列4的第3249位点c — a)。以上述I)得到的去除HindIII酶切位点的载体为模板，利用突变引物PstI5’和PstI3’进行PCR扩增，得到3694bp的突变产物。突变引物PstI5’和PstI3’下划线部分为原PstI位点，小写字母为突变后的碱基。上述PCR为20iil反应体系，载体加入量约为150ng ;反应条件为95°C 2min，(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循环，72°C 5min。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎,而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。因此将上述突变产物用DpnI消化后转入DH5 a，得到转化子。提取转化子的质粒，经MluI和PstI双酶切，只得到3694bp条带的为阳性质粒。将上述阳性质粒送去测序，结果为该阳性质粒的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；将该阳性质粒命名为PYBA，大小为3694bp，为双元载体。上述结果表明，pYBA自5’末端至3’末端依次由大肠杆菌复制起始原点ColEl、农杆菌复制起始原点R印-ori、调节蛋白R印表达框、T-DNA超驱动区(OD)、T-DNA右边界、MluI限制性内酶切位点、T-DNA左边界和Kan抗性基因表达框组成；所述大肠杆菌复制起始原点ColEl为序列表中序列4自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；所述农杆菌复制起始原点Rep-ori为序列表中序列4自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；所述调节蛋白Rep表达框为序列表中序列4自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段；所述Kan抗性基因表达框为序列表中序列4自5’末端第2448-3694位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第4120-5366位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第4351-5597位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序 列3自5’末端第3877-5123位核苷酸所示的双链DNA片段；其蛋白的表达与质粒5’-3’顺序相反；所述T-DNA超驱动区为序列表中序列4自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段；所述T-DNA左边界为序列表中序列4自5’末端第2423-2447位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第4095-4119位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第4326-4350位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第3852-3876位核苷酸所示的双链DNA片段；所述T-DNA右边界为序列表中序列4自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列I自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述MluI限制性内酶切位点的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第2417-2422位核苷酸；也为序列表中序列I自5’末端第2417-2422位和4089-4094位核苷酸；序列表中序列2自5’末端第2417-2422位和4320-4325位核苷酸；序列表中序列3自5’末端第2417-2422位和3846-3851位核苷酸。4、pYBA双元载体骨架的鉴定研究I)验证pYBA双元载体拷贝数的高低载体pBBBast为pBBRlMCS-2派生质粒，使用的是广谱复制原点。虽然其可以穿梭于大肠杆菌和农杆菌，但其在大肠杆菌中为低拷贝，不太便于基因工程操。在新载体的构建中，为了获得在大肠杆菌中高拷贝的质粒，选用了 PUC19的ColEl复制原点，保障了构建的新载体在大肠杆菌中高的拷贝数；而来源于pBBBast的ori-Rep基因片段则保障了新载体可以在农杆菌中自我复制。将上述3 得到的 pYBA 双兀载体与质粒 pBBBasta、pGreen0029、pUC19、pBluescriptIIKS (+)分别转入大肠杆菌DH5 a中，且在菌液浓度均约为0D_=2. 0时，分别提取3ml菌液的质粒DNA，溶于30 ill ddH20中，各取4 ill单酶切，粗略估测质粒浓度。结果如图2 所不，1-6 号泳道分别为 Ikb plus DNA Ladder、pBBBasta 6559bp、pGreen00294632bp、pYBA 3694bp、pUC19 2686bp、pBluescript II KS (+) 2961bp ;2 和 3为EcoRI酶切，4-6为HindIII酶切，可以看出，相同条件下pYBA与高拷贝质粒pUC 19，pBluescript IIKS(+)和pGreen0029浓度基本相当，明显高于低拷贝质粒pBBBasta。2) Kan基因的T546突变为G546对pYBA抗性的影响通过上述测序结果可以看出Kan抗性基因表达框中的G546 (位于序列4的第2883位核苷酸)为突变。在定点突变去除PstI位点时，无意中将Kan基因的T546突变为G546 (序列4自5’末端方向的A2883 — C2883)，这个突变致使氨基酸由天冬氨酸变为谷氨酸(图I中Kan基因标*位置)。为了检验该位点的突变是否会引起抗性发生变化，进行如下实验将序列4的第2883位核苷酸未突变质粒，转入大肠杆菌DH5 a中，得到转化未突变质粒的大肠杆菌DH5 a。将上述I)得到的转化了 pYBA的大肠杆菌DH5a和转化未突变质粒的大肠杆菌DH5a，用50mg/L-5000mg/L不同梯度的卡那霉素筛选浓度进行了鉴定(50 1000mg/L以每50mg为一梯度；1000 5000mg/L以每IOOOmg为一梯度)，结果显不50 1000mg/L浓度下Kan突变前后抗性无差别，菌株均可生长。当卡那霉素浓度增加到2000mg/L时，只有含突变质粒的菌株可以生长，而含未突变质粒的菌株则不能生长。3000mg/L以上浓度菌株均不能生长。可以看出该Kan546位点突变，使突变质粒抗性增强。基于以上结果，保留该突变质粒骨架pYBA，用于后续载体构建，并在构建T-DNA植物筛选标记表达框时以该Kan546突变基因为模板进行植物筛选标记表达框构建。二、双元载体pYBAlOO的构建I、含有筛选标记基因表达框的DNA片段的组件获得I)两串联同向的LoxP-FRT片段的获得
在T-DNA区段植物筛选标记基因表达框两侧，设计预留重组酶Cre和Flp识别位点LoxP和FRT组成的LoxP-FRT融合位点，方便在获得转基因植物后能将标记基因删除。因LoxP和FRT位点均为由34bp组成的发卡互补序列，融合位点LoxP-FRT的发卡结构十分严重。构建含两串联同向的LoxP-FRT片段由上海捷瑞公司人工合成，其核苷酸序列为
5 ’ -ccgacgcgtcacgtGAAGTTCCTA11c|<TT1'CTAGA<|iaATA(；GAACTTCri taac t icgta tik<gcatacat<\ IaIacgaagttati
ggcgcgccattaataggcctcgtacg GM(;TTCCI'ATAC|<11TCTAGA<|GAATAGGMa'TC/ taac11cgta u\(gca taca t<\ la tacgaagt ta t accggtttaaacgcgtcgg-3，。下划线部分为限制性内切酶位点，依次为MluI-PlmI，Ascl-AseI-StuI-BsiffI,AgeI-PmeI-DraI-MluI ;大写字母部分为FRT位点，小写斜体部分为LoxP位点，方框部分依次为FRT和LoxP位点决定方向的8bp核心序列，序列中的箭头指向为核心序列方向。2)新多克隆酶切识别位点new MCS片段的获得多克隆位点的构建是基于pBluescript II KS(+)载体的MCS,通过设计引物MCS5’和MCS3’在原有MCS上增加了 AgeI-MfeI和PmeI-DraI-NruI五个酶切位点，具体如下以pBluescript II KS (+)载体为模板，用引物MCS5’和MCS3’经PCR扩增获得154bp newMCS片段，经测序，为序列表中序列I或序列2或序列3的自5’末端第2421-2563位核苷酸，new MCS片段中的多克隆位点自5’末端至3’末端具体为依次为DraI识别位点、PmeI识别位点、NruI识别位点、KpnI位点或Acc651识别位点、ApaI位点或PspOMI识别位点、Eco0109I识别位点、XhoI识别位点、PspXI识别位点、SalI识别位点、ClaI识别位点、HindIII识别位点、EcoRV识别位点、EcoRI识别位点、PstI识别位点、SmaI位点或XmaI的识别位点、BamHI识别位点、SpeI识别位点、NotI识别位点、AleI识别位点、SacI识别位点、MfeI识别位点、AgeI识别位点；共22种内切识别序列。3)植物筛选标记基因表达框的获得 参考GenBank: AF485783. I的Nos启动子和终止子序列。以PBI121质粒为模板，用引物NosP5’(下划线部分为AscI位点)和NosP3’进行扩增，得到337bp的Nos-P片段，为序列表中序列I自5，末端第3681-4016位核苷酸；
以PBI121质粒为模板，用引物NosT5’和NosT3’(下划线部分为AseI位点)进行扩增，得到285bp的Nos-T片段，为序列表中序列I自5’末端第2644-2926位核苷酸；以上述一得到的pYBA骨架(骨架的kan抗性基因表达框也是nptll基因，只是启动子和终止子不同)为模板，用引物NptII5’和NptII3’扩增获得833bp的NptII片段，为序列表中序列I自5’末端第2886-3718位核苷酸。引物NosP3’和NptII5’、NptII3’和NosT5，分别为部分反向互补序列。所有PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，去除多余引物。然后以Nos-P、NptII和Nos-T三个片段为模板，用引物NosP5’和NosT3’进行融合PCR，得到1376bp筛选标记基因NptII表达框的片段，为序列表中序列I自5’末端第2644-4016位核苷酸。上述融合PCR 反应体系如下5x FastPfu Buffer 4 u 1,2. 5mM dNTPs 2u I,FastPfu DNAPolymerase 0. 4 U I, Nos-P 0. 2 U I, NptII 0. 2 U I, Nos-T 0. 2 U I 补水至19. 6 u I。循环反应为95V2min, (95。。20s，54。。20s, 72°C lmin) x48,72°C 5min ;前 12 个循环不加引物，在第13个循环时加入引物NosP5’ 0. 6iil，NosT3’ 0.6u I02、双元载体pYBAlOO的构建I)含有两串联同向的LoxP-FRT片段的中间载体用MluI分别酶切上述I得到的含有两串联同向的LoxP-FRT片段和上述一得到的pYBA骨架，连接得到获得中间载体pYBA-LF ;经过测序该质粒为将含有两串联同向的LoxP-FRT片段插入pYBA的MluI酶切位点间，为含有两串联同向的LoxP-FRT片段的中间载体。2)含有两串联同向的LoxP-FRT片段和new MCS片段的中间载体用DraI和AgeI分别酶切上述I得到的多克隆位点new MCS片段和上述I)得到的中间载体pYBA-LF，连接酶切产物，得到中间载体pYBA-LFM ;经过测序该质粒为将new MCS片段(序列表中序列I自5’末端第2421-2563位核苷酸)插入pYBA-LF的DraI和AgeI酶切位点间，得到含有两串联同向的LoxP-FRT片段和new MCS片段的中间载体pYBA-LFM。3)植物筛选标记基因表达框的添加用AseI和AscI分别酶切上述I得到的含有筛选标记基因NptII表达框的片段和上述2)得到的中间载体pYBA-LFM，连接酶切产物，连接产物转入DH5 a，得到转化子。将转化子的质粒进行MluI酶切验证，得到3694bp载体骨架和1672bp片段的为阳性质粒。将上述阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列I自5’末端第2417-4094位核苷酸插入pYBA的MluI限制性内酶间得到的载体，命名为pYBAlOO，该质粒的核苷酸序列为序列表中的序列1，大小为5366bp。结构示意图如图3所示。序列表中的序列I自5’末端第2417-4094位核苷酸表示片段自5’末端至3’末端依次包括多克隆酶切识别位点、右侧LoxP-FRT融合位点、BsiWI、StuI和AseI识别序列组、NPtII基因表达框、AscI酶切识别序列、左侧LoxP-FRT融合位点和PmlI酶切识别序列。所述多克隆酶切识别位点为22个内切酶识别位点，自5’末端至3’末端具体依次为DraI识别位点、PmeI识别位点、NruI识别位点、识别位点甲、识别位点乙、Eco0109I识别位点、XhoI识别位点、PspXI识别位点、Sal I识别位点、ClaI识别位点、Hindi 11识别位点、EcoRV识别位点、EcoRI识别位点、PstI识别位点、识别位点丙、BamHI识别位点、SpeI识别位点、NotI识别位点、AleI识别位点、SacI识别位点、MfeI识别位点、AgeI识别位点；所述识别位点甲为KpnI位点或Acc65I识别位点；所述识别位点乙为ApaI位点或PspOMI识别位点；所述识别位点丙为SmaI位点或XmaI的识别位点；所述PmlI酶切识别序列为序列表中序列I自5’末端第4083-4088位核苷酸所示的双链DNA片段；所述AscI酶切识别序列为序列表中序列I自5’末端第4008-4015位核苷酸所示的双链DNA片段；所述BsiWI、StuI和AseI识别序列组为序列表中序列I自5’末端第2632-2649位核苷酸所示的双链DNA片段；所述多克隆酶切识别序列为序列表中序列I自5’末端第2421-2563位核苷酸所 示的双链DNA片段；所述左侧LoxP-FRT融合位点为序列表中序列I自5’末端第4016-4083位核苷酸所示的双链DNA片段；所述右侧LoxP-FRT融合位点为序列表中序列I自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段；所述NptII基因表达框为序列表中序列I自5’末端第2650-4007位核苷酸所示的双链DNA片段。三、pYBA200双元载体构建pCAMBIA1300载体的抗性基因Hyg中含AgeI酶切位点。为了消除该位点对新载体后期MCS的影响，采用同前述PstI定点突变的办法将该位点去除。突变原则是选用单双子叶植物偏好兼并密码子，在不改变氨基酸序列的情况下，改变Hyg基因的342核酸序列(g — a)。I)以上述pCAMBIA1300载体为模板，利用突变引物AgeI5’和AgeI3’进行PCR扩增，得到8958bp的突变产物。突变弓丨物Age15 ’和Age13 ’下划线部分为原AgeI位点，小写字母为突变后的碱基。上述PCR为20iil反应体系，载体加入量约为150ng ;反应条件为95°C 2min，(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循环，72°C 5min。将上述PCR产物用DpnI消化后转入DH5 a，得到转化子。pCAMBIA1300含2个AgeI酶切位点。提取转化子的质粒，经AgeI酶切，只得到8958bp单一条带的为阳性质粒，即得到pCAMBIA1300突变质粒，经过测序，该质粒的抗性基因Hyg中不含AgeI酶切位点，在不改变氨基酸序列的情况下，改变Hyg基因的342核酸序列(g — a)。2) Hyg植物筛选标记基因表达框的获得方法和过程同NosP-NptII-NosT表达框。以pBI121质粒为模板，用引物NosP5’(下划线部分为AscI位点)和Hyg-NosP3’进行扩增，得到338bp的Nos-Pllyg片段，为序列2自5’末端第3912-4246位核苷酸；以PBI121质粒为模板，用引物Hyg-NosT5’和NosT3’(下划线部分为AseI位点)进行扩增，得到284bp的Nos-Tllyg片段，为序列2自5’末端第2644-2925位核苷酸；以上述I)得到的pCAMBIA1300突变质粒为模板，用引物Hyg5’和Hyg3’扩增获得1067bp的Hyg片段，为序列2自5’末端第2886-3952位核苷酸。引物Hyg_NosP3’和Hyg5’、Hyg3’和Hyg-NosT5’分别为部分反向互补序列。所有PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，去除多余引物。然后以Nos-PHyg、Hyg和Nos-Tllyg三个片段为模板，用引物NosP5’和NosT3’进行融合PCR，得到1607bp筛选标记基因Hyg表达框，为序列2自5’末端第2644-4246位核苷酸。
上述融合PCR 反应体系如下5x FastPfu Buffer 4 u 1,2. 5mM dNTPs 2u I,FastPfu DNAPolymerase 0. 4 U I, Nos-P 0. 2 U I, NptII 0. 2 U I, Nos-T 0. 2 U I 补水至19. 6 u I。循环反应为95°C2min, (95°C 20s,54°C 20s, 72°C lmin) x48,72°C 5min ;前 12 个循环不加引物，在第13个循环时加入引物NosP5’ 0. 6iil，NosT3’ 0.6u I03)植物筛选标记Hyg基因表达框的添加用AseI和AscI分别酶切上述2)得到的筛选标记基因表达框和上述2的2)中得到的中间载体pYBA-LFM，连接酶切产物，连接产物转入DH5 a，得到转化子。将转化子的质粒进行MluI酶切验证，得到3694bp载体骨架和1903bp片段为阳性质粒。将上述阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列2的自5’末端第2417-4325位核苷酸插入PYBA的MluI限制性内酶间得到的载体，命名为PYBA200，该质粒的核苷酸序列为序列表中的序列2，大小为5597bp，结构示意图如图4所示。序列表中的序列2自5’末端第2417-4325位核苷酸表示片段自5’末端至3’末端依次包括多克隆酶切识别位点、右侧LoxP-FRT融合位点、BsiWI、StuI和AseI识别序列组、Hyg基因表达框、AscI酶切识别序列、左侧LoxP-FRT融合位点和PmlI酶切识别序列。所述PmlI酶切识别位点为序列表中的序列2自5’末端第4314-4319位核苷酸所示的双链DNA片段；所述AscI酶切识别位点为序列表中的序列2自5’末端第4239-4246位核苷酸所示的双链DNA片段；所述BsiWI、StuI和AseI识别序列组为序列表中的序列2自5’末端第2632-2649位核苷酸所示的双链DNA片段；所述多克隆酶切识别位点为序列表中的序列2自5’末端第2421-2563位核苷酸所示的双链DNA片段；所述左侧LoxP-FRT融合位点为序列表中的序列2自5’末端第4247-4314位核苷酸所示的双链DNA片段；所述右侧LoxP-FRT融合位点为序列表中的序列2自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段；所述Hyg基因表达框为序列表中序列2自5’末端第2650-4238位核苷酸所不的双链DNA片段。三、pYBA300双元载体的构建
pBBBasta载体的抗性基因Bar中含KpnI、SalI和ApaI酶切位点。为了消除这3个位点对新载体后期MCS的影响，采用同PstI定点突变的办法将该位点去除。突变原则是选用单双子叶植物偏好兼并密码子，在不改变氨基酸序列的情况下，改变Bar基因第516位核酸序列KpnI (a — t，即序列3中第2942位核酸t — a)、第267位核酸Sail (g — t，即序列3中第3191位核酸c — a)、第222位核酸ApaI (g — t，即序列3中第3236位核酸c — a)0I)以上述pBBBasta载体为模板，利用突变引物KpnI5’和KpnI3’进行PCR扩增，得到6558bp的突变产物。突变引物KpnI5’和KpnI3’下划线部分为原KpnI位点，小写字母为突变后的碱基。上述PCR为20iil反应体系，载体加入量约为150ng ;反应条件为95°C 2min,(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循环，72°C 5min。
将上述PCR产物用DpnI消化后转入DH5 a，得到转化子。提取转化子的质粒，经EcoRI和KpnI双酶切，只得到6558bp —条带的为阳性中间质粒I。2)以上述I)得到的中间质粒为模板，利用突变引物Sal 15’和Sal 13’进行PCR扩增，得到6558bp的突变产物。突变引物Sal 15 ’和Sal 13 ’下划线部分为原Sal I位点，小写字母为突变后的碱基。上述PCR为20iil反应体系，载体加入量约为150ng ;反应条件为95°C 2min,(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循环，72°C 5min。将上述PCR产物用DpnI消化后转入DH5 a，得到转化子。提取转化子的质粒，经EcoRI和SalI双酶切，只得到6558bp —条带的为阳性中间质粒2。3)以上述2)得到的阳性中间质粒2为模板，利用突变引物ApaI5’和ApaI3’进行PCR扩增，得到6558bp的突变产物。突变弓丨物ApaI5 ’和ApaI3 ’下划线部分为原ApaI位点，小写字母为突变后的碱基。上述PCR为20iil反应体系，载体加入量约为150ng ;反应条件为95°C 2min，(95°C 20s, 62°C 20s, 72°C 5min) xl8 循环，72°C 5min。将上述PCR产物用DpnI消化后转入DH5 a，得到转化子。提取转化子的质粒，经EcoRI和ApaI双酶切，只得到6558bp —条带的为阳性质粒即为pBBBasta突变质粒。4) Bar植物筛选标记基因表达框的获得方法和过程同NosP-NptII-NosT表达框。以pBI121质粒为模板，用引物NosP5’(下划线部分为AscI位点)和Bar_NosP3’进行扩增，得到335bp的Nos-Pto片段，为序列表中序列3自5’末端第3440-3773位核苷酸；以pBI121质粒为模板，用引物Bar_NosT5’和NosT3’(下划线部分为AseI位点)进行扩增，得到286bp的Nos-Tto片段，为序列表中序列3自5’末端第2644-2925位核苷酸；以上述3)得到的pBBBasta突变质粒为模板，用引物Bar5’和Bar3’扩增获得600bp的Bar片段，为序列表中序列3自5’末端第2885-3478位核苷酸。引物Bar_NosP3’和Bar5’、Bar3’和Bar_NosT5’分别为部分反向互补序列。所有PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，去除多余引物。然后以Nos-PBar、Bar和Nos-Tto三个片段为模板，用引物NosP5’和NosT3’进行融合PCR，得到1133bp筛选标记基因Bar表达框，为序列表中序列3自5’末端第2644-3773位核苷酸。上述融合PCR 反应体系如下5x FastPfu Buffer 4 u 1,2. 5mM dNTPs 2u I,FastPfu DNAPolymerase 0. 4 U I, Nos-P 0. 2 U I, NptII 0. 2 U I, Nos-T 0. 2 U I 补水至19. 6 u I。循环反应为95V2min, (95。。20s，54。。20s, 72°C lmin) x48,72°C 5min ;前 12 个循环不加引物，在第13个循环时加入引物NosP5’ 0. 6iil，NosT3’ 0.6u I05) pYBA植物筛选标记Bar基因表达框的添加用AseI和AscI分别酶切上述4)得到的筛选标记基因表达框和上述2的2)得到的中间载体pYBA-LFM，连接酶切产物，连接产物转入DH5 a，得到转化子。将转化子的质粒进行MluI酶切验证，得到3694bp载体骨架和1429bp片段的为阳性质粒。将上述阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列3的自5’末端第2417-3851位核苷酸插入PYBA的MluI限制性内酶间得到的载体，命名为PYBA300，该质粒的核苷酸序列为序列表中的序列3，大小为5123bp，结构示意图如图5所示。序列表中的序列3自5’末端第2417-3851位核苷酸表示片段自5’末端至3’末端依次包括多克隆酶切识别位点、右侧LoxP-FRT融合位点、BsiWI、StuI和AseI识别序列组、Bar基因表达框、AscI酶切识别序列、左侧LoxP-FRT融合位点和PmlI酶切识别序列。所述PmlI酶切识别位点为序列表中的序列3自5’末端第3840-3845位核苷酸所示的双链DNA片段；所述AscI酶切识别位点为序列表中的序列3自5’末端第3765-3772位核苷酸所示的双链DNA片段；所述BsiWI、StuI和AseI识别序列组为序列表中的序列3自5’末端第2632-2649位核苷酸所示的双链DNA片段；所述多克隆酶切识别位点为序列表中的序列3自5’末端第2421-2563位核苷酸所示的双链DNA片段；所述左侧LoxP-FRT融合位点为序列表中的序列3自5’末端第3773-3840位核苷酸所示的双链DNA片段；所述右侧LoxP-FRT融合位点为序列表中的序列3自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段；所述Bar基因表达框为序列表中序列3自5’末端第2650-3764位核苷酸所不的 双链DNA片段。实施例2、pYBAlOO、pYBA200、pYBA300 双元载体的应用I、拟南芥的转化与鉴定利用电击法将由实施例I得到的pYBAlOO、pYBA200、pYBA300载体分别转入根癌农杆菌 GV3101:pMP90 菌株，分别得至Ij GV3101:pMP90/pYBA100、GV3101 :pMP90/pYBA200、GV3101:pMP90/pYBA300oI) GV3101 :pMP90/pYBAlOO进行花序浸溃法侵染32棵野生型拟南芥，为TO代。将32株TO代收获的转基因拟南芥种子经消毒后，播于含100mg/L Kan的Hoagland/2固体培养基，放到条件为25°C，光周期为16h (光)/8h (暗)的培养室，约2周后挑选56株存活Tl代转基因拟南芥绿苗移栽人工气候室。随机挑选36株Tl代转基因拟南芥，提取幼苗叶片的基因组DNA，以引物NosP5’和MCS3’进行PCR扩增检测，以pYBAlOO质粒为阳性对照，以野生型拟南芥为阴性对照，结果如图6所示，I:阴性对照(野生型拟南芥)；2: Ikb plus DNA Ladder ；3:阳性对照pYBAlOO质粒；4-12:Tl代转基因拟南芥，结果为得到1.6kb的片段为阳性植株，共得 到31株PCR检测为阳性Tl代转基因拟南芥苗；1. 6kb的PCR产物经测序，确认插入的T-DNA区段为从Nos-Pro至MCS片段，I. 6kb的PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中序列I自5’末端第2421-4016位核苷酸，说明T-DNA区段已经整合到植物基因组中。2)按照上述I)的方法将GV3101:pMP90/pYBA200进行转入20棵野生型拟南芥，得到为TO代。将20株TO代收获的转基因拟南芥种子经消毒后，播于含25mg/L Hgromycin的Hoagland/2固体培养基，放到条件为25°C，光周期为16h (光)/8h (暗)的培养室，约2周后挑选9株存活Tl代转基因拟南芥绿苗移栽人工气候室。以上述9株Tl代转基因拟南芥，提取幼苗叶片的基因组DNA，以引物NosP5’和MCS3’进行PCR扩增检测，以野生型拟南芥为阴性对照，结果如图7所示，I:阴性对照(野生型拟南芥)；2:lkb plus DNA Ladder ；3-ll:Tl代转基因拟南芥，结果为得到约I. 8kb的片段为阳性植株，共得到8株PCR检测为阳性Tl代转基因拟南芥苗；1. 8kb的PCR产物经测序，确认插入的T-DNA区段为从Nos-Pro至MCS片段，I. 8kb的PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第2421-4247位核苷酸，说明T-DNA区段已经整合到植物基因组中。3)按照上述I)的方法将GV3101:pMP90/pYBA300进行转入64棵野生型拟南芥，得到为TO代。将64株TO代收获的转基因拟南芥种子播种人工气候室，条件为21°C，光周期为16h (光)/8h (Hf),约I周后喷洒0. 2%Basta除草剂，共有463株存活Tl代转基因拟南芥绿苗。随机挑选10株Tl代转基因拟南芥，提取幼苗叶片的基因组DNA，以引物NosP5’和MCS3’进行PCR扩增检测，以野生型拟南芥为阴性对照，结果如图8所示，I:阴性对照(野生型拟南芥);2:lkb plus DNA Ladder ；3-12:Tl代转基因拟南芥，结果为得到I. 35kb的片段为阳性植株，共得到9株PCR检测为阳性Tl代转基因拟南芥苗；1. 35kb的PCR产物经测序，确认插入的T-DNA区段为从Nos-Pro至MCS片段，I. 35kb的PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中序列3自5’末端第2421-3773位核苷酸，说明T-DNA区段已经整合到植物基因组中。从上述的实验结果可以看出最初构建新双元载体的目标，是获得尽可能小的、高拷贝数、MCS位点多、方便基因工程操作、后期能将植物选择标记基因删除的载体；新构建的载体PYBA系列载体由于使用了大肠杆菌复制原点ColEl和农杆菌复制起始原点R印-ori，可在大肠杆菌和农杆菌中复制，且具有较高的复制能力，方便了基因工程操作。构建pYBA系列载体时考虑到要尽量使载体最小化，且使将来获得的转基因植物更加“干净”，尽量将一切非必需的元件去除，包括LacZ系统及用于测序的一些通用引物结合位点。pYBA系列与pGreen系列一样使用了著名克隆载体pBluescript II的多克隆位点，并通过合成添加了一些新的单酶切位点。PYBA系列载体的MCS含22个单酶切位点，这将能满足绝大部分的基因工程操作的需要。本发明在构建pYBA系列载体时，在除22个MCS位点外，在两同向LoxP-FRT位点内侧另预留了 3个单酶切位点AseI-StuI-BsiWI，用于将来方便插入诱导系统和重组酶系统。PYBA系列的融合LoxP-FRT位点，可以被重组酶Cre或FLP的识别。转基因植物获得后，既可以通过诱导重组酶表达，也可通过共转化或杂交引入重组酶，将两同向LoxP-FRT位点内所有序列删除。 重组酶FLP和Cre的识别位点FRT和LoxP的核心序列均为34bp。位点中间为8bp 的核心间隔区，其决定了识别位点的方向，两侧均为13bp的反向互补序列。通常利用FLP/FRT重组系统实验中所用到的FRT位点在34bp核心序列的5’前端还含有一段14bp的第三组重复序列，组成一个长为48bp含三组重复的序列。虽然FLP识别并结合全部3个重复序列，然而这个14bp的第三组重复序列在重组切割过程中为非必需的部分。为了方便合成LoxP-FRT位点，且能最小化新构建的载体，因此本实验构建的LoxP-FRT位点不包含非必需的第三组重复序列及4bp的间隔序列部分，位点为LoxP — FRT方向串联。农杆菌介导的植物转化中，当T-DNA与植物基因组整合时，RB先于LB进入植物细胞。植物筛选标记基因位于LB端，可防止因目的基因在整合过程中丢失所造成的假阳性植株，便于目的基因插入的筛选。然而早期构建的一些双元载体许多都忽略了这一点，将筛选标记基因置于了 RB端(如pBI121和pBIN19)。考虑到植物筛选标记基因在T-DNA内位置的重要性，本实验构建的PYBA系列双元表达载体的植物筛选标记基因置于LB端，减少了获得假阳性植株的机率。小体积的高拷贝大肠杆菌质粒通常还用于非农杆菌介导的植物细胞或原生质体转化；如基因枪、电击、PEG转化等。pYBA系列体积小、拷贝数高，MCS位点多，亦可胜任这项工作。此外，在LB-RB内侧两边留有MluI、RmlI酶切位点，结合MCS位点可以将除LB和RB以外的T-DNA区段整体切除下来，以线性DNA方式用于基因枪等单子叶植物的安全遗传转化。因此，pYBA系列载体能于大肠杆菌和农杆菌中复制，并能成功转化拟南芥。pYBA双元表达载体的骨架和T-DNA区段均符合农杆菌介导的植物转基因要求。在pYBA的基础上，将陆续开发一系列用于不同目的新植物表达双元载体。实施例3、pYBAlOO、pYBA200、pYBA300双元载体中的筛选标记基因表达框删除验证为了检测重组酶位点能否准确将植物筛选标记基因表达框删除，设计了体外删除实验。分别取0. 5 ii g由实施例2得到的pYBA100、pYBA200、pYBA300质粒DNA，与I yl Cre重组酶IOx Cre Buffer 混合，水补足至 30 y I。37 °C 60min,70°C 5min。取 5 y I 重组产物转化大肠杆菌。随机抽取了 12个克隆提取质粒DNA，用EcoRI酶，1%琼脂糖电泳验证。结果如图9所示，pYBAlOO的12个克隆中有2个(5和13泳道)经Cre重组后，剔除了目的片段(I. 45kb)，质粒缩小为3. Qlkb0结果如图10所示，pYBA200的12个克隆中有I个(第3泳道)经Cre重组后，剔除了目的片段(I. 68kb)，质粒缩小为3. Qlkb0结果如图11所示，pYBA300的12个克隆中有5个(4、5、6、7和9泳道)经Cre重组后，剔除了目的片段(I. 20kb)，质粒缩小为3. 91kb。用引物MCS3’分别对缩小的质粒测序。测序结果证明两同向LoxP-FRT位点内所有序列删除。结果证明载体pYBA系列载体能经Cre重组酶重组，删除两个同向LoxP-FRT位点间植物筛选标记基因表达框。
权利要求
1.一种载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌复制起始原点ColEl、农杆菌复制起始原点R印-ori、调节蛋白R印表达框、T-DNA超驱动区、T-DNA右边界、T-DNA左边界和Kan抗性基因表达框。
2.根据权利要求I所述的载体，其特征在于 所述大肠杆菌复制起始原点ColEl为序列表中序列4自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述农杆菌复制起始原点Rep-ori为序列表中序列4自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述调节蛋白Rep表达框为序列表中序列4自5’末端第1386-2367位核苷酸所示的双链DNA片段。
所述Kan抗性基因表达框为序列表中序列4自5’末端第2448-3694位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述T-DNA超驱动区为序列表中序列4自5’末端第2368-2391位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述T-DNA左边界为序列表中序列4自5’末端第2423-2477位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述T-DNA右边界为序列表中序列4自5’末端第2392-2416位核苷酸所示的双链DNA片段。
3.根据权利要求I或2所述的载体，其特征在于 在所述T-DNA右边界和所述T-DNA左边界之间还包括内酶切识别位点I ; 所述内酶切识别位点I具体为MluI的识别位点。
4.根据权利要求1-3中任一所述的载体，其特征在于 所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列4。
5.根据权利要求1-3中任一所述的载体,其特征在于 在所述T-DNA右边界和所述T-DNA左边界之间还包括含有植物筛选标记基因表达框的片段， 所述含有植物筛选标记基因表达框的片段自5’末端至3’末端依次包括多克隆酶切识别位点、右侧LoxP-FRT融合位点、植物筛选标记基因表达框和左侧LoxP-FRT融合位点。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于 所述多克隆酶切识别位点为22个内切酶识别位点，所述22个内切酶识别位点自5’末端至3’末端具体依次为DraI识别位点、PmeI识别位点、NruI识别位点、识别位点甲、识别位点乙、Eco0109I识别位点、XhoI识别位点、PspXI识别位点、SalI识别位点、ClaI识别位点、HindIII识别位点、EcoRV识别位点、EcoRI识别位点、PstI识别位点、识别位点丙、BamHI识别位点、SpeI识别位点、NotI识别位点、AleI识别位点、SacI识别位点、MfeI识别位点、AgeI识别位点； 所述识别位点甲为KpnI位点或Acc651识别位点； 所述识别位点乙为ApaI位点或PspOMI识别位点； 所述识别位点丙为SmaI位点或XmaI的识别位点； 所述植物筛选标记基因表达框为NotII基因表达框、Hyg基因表达框或Bar基因表达框。
7.根据权利要求5或6所述的载体，其特征在于 所述左侧LoxP-FRT融合位点为序列表中序列I自5’末端第4016-4083位核苷酸所示的双链DNA片段或序列2的自5’末端第4247-4314位所示的双链DNA片段或序列3的自5’末端第3773-3840位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述右侧LoxP-FRT融合位点为序列表中序列I自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段或序列2的自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段或序列3的自5’末端第2564-2631位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述NptII基因表达框为序列表中序列I自5’末端第2650-4007位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述Hyg基因表达框为序列表中序列2自5’末端第2650-4238位所示的双链DNA片段； 所述Bar基因表达框为序列表中序列3自5’末端第2650-3764位所示的双链DNA片段。
8.根据权利要求5-7中任一所述的载体,其特征在于 在所述左侧LoxP-FRT融合位点和所述T-DNA左边界之间还包括内切酶识别位点2 ;所述内切酶识别位点2具体为PmlI识别位点； 在所述左侧LoxP-FRT融合位点和所述筛选标记基因表达框之间还包括内切酶识别位点3 ;所述内切酶识别位点3具体为AscI识别位点； 在所述植物筛选标记基因表达框和所述右侧LoxP-FRT融合位点之间还包括由多个内切酶识别位点组成内切酶识别位点组；所述内切酶识别位点组自5’末端至3’末端具体依次为BsiWI识别序列、StuI识别序列和AseI识别序列。
9.根据权利要求5-8中任一所述的载体,其特征在于 所述载体为如下I)或2)或3): 1)所述载体中植物筛选标记基因为NptII基因，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 2)所述载体中植物筛选标记基因为Hyg基因，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 3)所述载体中植物筛选标记基因为Bar基因，所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列3。
10.权利要求1-9任一所述的载体在培育转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种含LoxP-FRT重组酶位点的植物双元表达载体。本发明提供了载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌复制起始原点ColEl、农杆菌复制起始原点Rep-ori、调节蛋白Rep表达框、T-DNA超驱动区、T-DNA右边界、T-DNA左边界和Kan抗性基因表达框。本发明的实验证明，本发明构建了植物表达双元载体pYBA100、pYBA200和pYBA300，其载体较小且在T-DNA区获得大量的MCS位点，离体删除实验结果证明，载体pYBA系列能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框，可以满足用于安全生产转基因植物的需要。
文档编号A01H5/00GK102676579SQ20121013520
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者姚磊, 王慧, 闫晓红, 马荣才 申请人:北京农业生物技术研究中心