专利名称：哈茨木霉t28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种防治致病疫霉菌生物制剂的制备方法，尤其是涉及一种哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法。
背景技术：
目前，致病疫霉(Phytophthorainfestans Montagne de Bary)是活体营养型的致病卵菌，在Ainsworth (1973)真菌分类系统中隶属真菌界(Kingdom Fungi)、真菌门(Eumycophyta)鞭毛菌亚门(Mastigomycotina)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)真菌。在现代生物分类系统中隶属假菌界(Kingdom Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属。马铃薯是世界第四大粮食作物，也是中国的重要粮、菜、色、饲和工业兼用原料。由致 病疫霉引起的马铃薯晚疫病是马铃薯的一种毁灭性病害，中国从20世纪80年代起，晚疫病的流行频率和流行程度逐渐加重，成为马铃薯生产的I个重要障碍。黑龙江许多马铃薯产区是全国的种薯基地，雨季集中在7、8月，正值马铃薯的结薯期；晚疫病一旦流行，减产很严重并且造成种薯带菌率高，成为用种地区晚疫病流行的重要原因。目前马铃薯晚疫病的防治极大程度上还是依赖于化学防治，这虽然给马铃薯生产带来了很高的效益，但是，环境污染、生态系统自然平衡的破坏等诸多弊端也随之而来。因此，寻找高效的生物防治菌株刻不容缓。哈茨木霉(Trichodermaharzianum)属于半知菌亚门(Deuteromycotina),丝抱纲(Hyphomycetidae),丝抱目(Hyphomycetales),木霉属(Trichoderma)。目前，国内针对哈茨木霉进行生物防治的研究比较多的集中于拮抗作用、抑菌成分、抑菌机理等方面。对于哈茨木霉抑菌活性成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法，经检索未发现与本发明相关的报道。哈茨木霉菌株T28抑菌活性成分制剂对致病疫霉菌室内生长抑制率接近70%，孢子囊萌发抑制率超过70%，游动孢子释放抑制率超过75%。采用该制剂浸种后播种、生长季节喷施制剂，可有效控制马铃薯晚疫病发生，同时可显著提高马铃薯产量。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术中存在的不足之处，提供一种哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是哈茨木霉T28发酵液的制备(I)采用改良马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，培养基按比例组成为马铃薯 100g-200g、葡萄糖 10g-20g、KH2P042g-3g、MgS04lg_2g、水 500ml-1000ml,发酵液pH5. 0-6. 0，进行液体发酵培养5-10天，接种量为发酵液体积的1%_2%，装液量为锥形瓶容积的35%，发酵培养条件为，温度25°C _30°C，摇床转数125r/min-150r/min ；
(2)哈茨木霉T28发酵液中抑菌活性成分提取将培养5-10天的哈茨木霉菌株T28发酵液用无菌纱布过滤，置于冷冻离心机中，在之后用O. 22 μ m的滤头过滤，将滤液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h_5h，水浴加热至50°C，搅拌、加速溶解，将滤液和乙醇的混合溶液浓缩至200ml，加入沸点为60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分离两部分溶剂，将水层与IOOOml乙醚混合，常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，将水层与IOOOml乙酸乙酯混合，在常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，弃水层，将乙酸乙酯层以50°C真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到抑菌活性成分；(3)哈茨木霉T28发酵液中抑菌成分制剂的制备将抑菌活性成分用10%吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10。本发明的优点是 本发明采用的原料为可再生的菌物资源，来源丰富、价廉，对由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有显著的抑制效果，本发明具有高效、低毒、无公害等特点，对防治由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有广泛的应用前景。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作进一步详细描述。实施例I、哈茨木霉T28发酵液的制备(I)采用改良马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，培养基按比例组成为马铃薯100g、葡萄糖10g、KH 2P042g、MgS04lg、水500ml，发酵液pH5. 0，进行液体发酵培养5天，接种量为发酵液体积的1%，装液量为锥形瓶容积的35%，发酵培养条件为，温度25°C，摇床转数125r/min ；(2)哈茨木霉T28发酵液中抑菌活性成分提取将培养5-10天的哈茨木霉菌株T28发酵液用无菌纱布过滤，置于冷冻离心机中，在之后用O. 22 μ m的滤头过滤，将滤液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h_5h，水浴加热至50°C，搅拌、加速溶解，将滤液和乙醇的混合溶液浓缩至200ml，加入沸点为60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分离两部分溶剂，将水层与IOOOml乙醚混合，常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，将水层与IOOOml乙酸乙酯混合，在常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，弃水层，将乙酸乙酯层以50°C真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到抑菌活性成分；(3)哈茨木霉T28发酵液中抑菌成分制剂的制备将抑菌活性成分用10%吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10。实施例2、哈茨木霉T28发酵液的制备(I)采用改良马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，培养基按比例组成为马铃薯200g、葡萄糖20g、KH 2P043g、MgS042g、水1000ml，发酵液pH6. 0，进行液体发酵培养10天，接种量为发酵液体积的2%，装液量为锥形瓶容积的35%，发酵培养条件为，温度30°C，摇床转数150r/min ；
(2)哈茨木霉T28发酵液中抑菌活性成分提取将培养5-10天的哈茨木霉菌株T28发酵液用无菌纱布过滤，置于冷冻离心机中，在之后用O. 22 μ m的滤头过滤，将滤液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h_5h，水浴加热至50°C，搅拌、加速溶解，将滤液和乙醇的混合溶液浓缩至200ml，加入沸点为60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分离两部分溶剂，将水层与IOOOml乙醚混合，常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，将水层与IOOOml乙酸乙酯混合，在常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，弃水层，将乙酸乙酯层以50°C真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到抑菌活性成分； (3)哈茨木霉T28发酵液中抑菌成分制剂的制备将抑菌活性成分用10%吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10。
权利要求
1.一种哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法，其特征在于 哈茨木霉T28发酵液的制备 (1)采用改良马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，培养基按比例组成为马铃薯 100g-200g、葡萄糖 10g-20g、KH2P042g-3g、MgS04lg_2g、水 500ml-1000ml,发酵液pH5. 0-6. 0，进行液体发酵培养5-10天，接种量为发酵液体积的1%_2%，装液量为锥形瓶容积的35%，发酵培养条件为，温度25°C _30°C，摇床转数125r/min-150r/min ； (2)哈茨木霉T28发酵液中抑菌活性成分提取将培养5-10天的哈茨木霉菌株T28发酵液用无菌纱布过滤，置于冷冻离心机中，在之后用0. 22 iim的滤头过滤，将滤液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h-5h，水浴加热至50°C，搅拌、加速溶解，将滤液和乙醇的混合溶液浓缩至200ml，加入沸点为60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分离两部分溶剂，将水层与IOOOml乙醚混合，常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，将水层与.1OOOml乙酸乙酯混合，在常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，弃水层，将乙酸乙酯层以.50°C真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到抑菌活性成分； (3)哈茨木霉T28发酵液中抑菌成分制剂的制备将抑菌活性成分用10%吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10。
全文摘要
本发明涉及一种哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法，采用PD培养基进行液体发酵，获得T28发酵液将发酵液过滤、冷冻离心、经0.22μm滤头过滤后，经乙醇浸浓缩后加入不同极性的有机溶剂分步骤进行提取(乙醚、乙酸乙酯)，将乙酸乙酯层以50℃真空旋转蒸发浓缩至黄色粉末挂壁；得到抑菌活性成分并溶于10%的吐温80溶液，得到制剂。本发明采用的原料为可再生的菌物资源，来源丰富、价廉，对由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有显著的抑制效果，本发明具有高效、低毒、无公害等特点，对防治由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有广泛的应用前景。
文档编号A01N63/04GK102696687SQ20121016069
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者宋瑞清, 杨立宾 申请人:东北林业大学