专利名称：含嗜酸乳杆菌的饲料添加剂在抗氧化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物应用技术，具体地说是涉及含嗜酸乳杆菌(LactobaciIIusacidophilus)新菌株的饲料添加剂在抗氧化中的应用。
背景技术：
动物体在新陈代谢的过程中会形成活性氧自由基，如超氧自由基(O2 ·-)、羟基自由基(HO·)、过氧化氢(H2O2)等，适量的自由基与稳定的氧分子维持着巧妙的生理平衡。活性氧自由基的消除主要依赖于机体的抗氧化防御系统的预防性或阻断性控制。机体内天然的抗氧化系统包括酶类及非酶类两大类，前者主要是指超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)过氧化物酶(P0D)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等。后者则是指一些小分子的有机物质，也称之为体内天然的抗氧化剂，如维生素E、维生素C、辅酶Q、半胱氨酸、谷胱甘肽及微量元素硒(Se)等。 由于许多化学合成的抗氧化物存在安全问题，因而发现安全的有抗氧化活性的天然产物，用以维持体内氧化还原的平衡，是一个人们长期关注和努力的问题。近年来的研究证实，乳酸杆菌具有不同的抗氧化活性，虽然其抗氧化活性己经得到了体内及体外实验的证实，但国内外的乳酸杆菌制品的研究状况表明还存在一些问题，尤其是应用于产品中的乳酸杆菌菌株的选择，既要有生理功能又要求菌体能耐受不利于生存的胃肠道的体内逆环境。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供含嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus) CGMCC No. 5093的饲料添加剂在提高肉鸡抗氧化性能中的应用。在本发明的一个实施方案中，所述饲料添加剂由嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093冻干粉和载体组成。其中，所述载体优选为脱脂奶粉。其中，嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093冻干粉和脱脂奶粉的重量比为1 I. 5 :1 10。其中，所述的嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093冻干粉的活菌数为IO1c1-IOllCfu/^在本发明的一个实施方案中，将所述饲料添加剂添加到肉鸡基础日粮中，使所述嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093的活菌数在基础日粮中达到107cfu/g以上。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus) CGMCC NO. 5093 已在CN201110396544. O 中公布。本发明提供的嗜酸乳杆菌既对胃肠道环境具有较强的耐受性，由其制备的饲料添加剂添加进肉鸡饲料中后，可升高肉鸡血清中SOD、CAT, GSH-Px活力，降低血清和肝脏中的MDA含量。因此，该菌株可用于开发成饲料添加剂或预混料添加进肉鸡的日粮中，提高肉鸡机体抗氧化性能，改善肉品质，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I嗜酸乳杆菌的耐受性分析益生菌在进入大肠之前必须适应或耐受胃中盐酸和小肠中高浓度胆盐的生活环境，能够与肠道内其它微生物竞争并达到可控制有害微生物繁殖所需的数量与存活率，这都是益生菌发挥作用的先决条件。I. I耐酸性试验嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093菌种活化2代后的液体培养物按2% (w/v)分别加入pH为2. O, 3. O, 4. O, 7. O (对照)的PBS缓冲液中，混匀后置37°C培养箱处理2h，稀释到适当浓度，而后取O. Iml菌悬液，进行平皿菌落计数，计算酸处理过的菌株存活率=A1AciXKKF0,A1为处理2h后的每毫升活菌数(CFU/mL)，A0为pH 7. O时每毫升活菌数(CFU/mL)。
1.2胆汁酸盐耐受性试验嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093菌种活化2代后的嗜酸乳杆菌液体培养物按2%接种量接入含猪胆汁酸钠分别为0% (对照)，0. 1%、0. 2%和O. 3%的PBS缓冲液中，混匀后置37°C培养箱处理2h，稀释到适当浓度，而后取O. Iml菌悬液，进行平皿菌落计数，计算酸处理过的菌株存活率=A1AtlX 100%, A1为处理2h后的每毫升活菌数(CFU/mL)，Atl为pH 7. O时每毫升活菌数(CFU/mL)。耐受性结果显示，经过37°C温育2h之后，嗜酸乳杆菌在pH2. 0、pH 3. O,pH 4. O的存活率分别为49. 2%,65. 1%、89· 6%。菌株在O. 1% (w/v),O. 2%和O. 3%浓度的猪胆盐经过37°C温育2h之后，存活率分别为95%，90%和78%。这表明该嗜酸乳杆菌菌株对胆盐有较好的耐受性。实施例2嗜酸乳杆菌的饲料添加剂的制备嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093的冻干粉的制备，包括如下步骤(I)菌株的活化将_80°C冻存保存的嗜酸乳杆菌按10%的接种量向MRS液体培养基中，培养条件为37°C，转速为160rpm，培养20-24h ；(2)种子液的制备将活化的发酵液按2%的接种量向发酵培养基中培养16h，所述的发酵培养基的成分及其质量体积比如下葡萄糖1%，大豆蛋白胨2%，酵母膏1%，硫酸铵O. 5%，磷酸氢二钾O. 2%、氯化钠O. 2%，硫酸镁O. 05% ；(3)按1-2%的接种量向发酵培养基中接入(2)所提供的嗜酸乳杆菌种子液，发酵条件为37°C，转速为160rpm，培养18h，得到的发酵液经5000rpm离心IOmin收集菌体，用灭菌蒸馏水洗涤后向菌体沉淀中加入20% (w/v)的冻干保护剂(配方为脱脂奶7%，海藻糖I. 5%，甘油2. 5%，谷氨酸钠I. 5%，无菌水IOOmL)，-80°C冷冻干燥20h，制成活菌数为5X10ncfu/g左右的冻干粉。将制备的冻干菌粉中与脱脂奶粉按质量比I :10混合均匀，即可得到本发明的嗜酸乳杆菌活菌制剂。实施例3含嗜酸乳杆菌的饲料添加剂在抗氧化中的应用I.实验方法I. I主要试剂
MDA, SOD、GSH-Px, CAT试剂盒由南京建成生物工程公司提供。I. 2实验动物及分组选取健康I日龄商品代AA肉鸡48只，随即分成试验组和对照组两个处理，每个处理4个重复，每个重复6只鸡，试验期为21天。I. 3试验日粮与饲养管理试验参照《家禽营养需要》(NRC，1994)设计，采用玉米-豆柏型日粮。对照组饲喂肉鸡常规日粮，试验组在常规日粮中添加实施例2所制备的活菌制剂(添加量为1%。)，不含任何抗生素，使基础日粮中活菌数为5 X 107cfu/g左右。按照本试验鸡场的常规管理程序进行免疫和日常管理，试验在同一栏舍内进行，饲养方式为四层阶梯式笼养，每笼均放3只鸡，每日两遍给饲，即上午8:00，下午4:00。固定专人饲喂，自由采食，自动饮水器饮水，随时观察鸡群的生产情况，发现疾病及时治疗。 I. 4测定指标血清指标超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)，丙二醛(MDA)，肝脏指标MDA含量。各项指标按照南京建成生物工程公司试剂盒使用说明书进行测定。I. 5样品制备第21天饲喂后禁食12h，每个重复组随即抽取3只鸡，取样测定各项指标。本发明中肉鸡血清的提取过程如下肉鸡心脏取血，4°C静置24h，部分血液离心(lOOOOrpm，IOmin)后分离红细胞和血清，测定SOD活力，GSH-Px活力，CAT活力，MDA含量。本发明中肝脏组织匀浆的制备方法如下肉鸡心脏采血后处死，取肝组织块，用预冷至4°C的生理盐水，除去血液，滤纸吸干，去掉结缔组织。称重后放入匀浆器中，加入9倍体积的预冷生理盐水，充分磨碎，使组织匀浆化。将稀释好的1:10组织匀浆液用低温离心机1500rpm离心IOmin,留上清液,测定MDA含量I. 6统计处理所有数据均用统计软件SPSS16. O软件进行统计学处理，采用ANOVA过程进行方差分析，各处理间平均值的比较采用LSD多重比较进行差异显著性检验，以p〈0. 05为差异显著。各项指标结果以均值土方差(Means土S. D.)表不。2.结果与分析2. I肉鸡血清中SOD活力、GSH-Px活力的测定结果SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。利用试剂盒所示方法测血清中SOD酶和GSH-Px活性值如表I所示。表I嗜酸乳杆菌活菌制剂对肉鸡血清中SOD活性、GSH-Px活力的影响
组别肉鸡数(只) SOD (U/mL) GSH-Px活力(U)吋问组6201.35 ±1.78*211.67 ±2 68 试验组 6 237.13 ± 1.25 231.05 + 2 33
注* p<0. 05，** p<0. 01由表I可见，试验组肉鸡的血清中SOD活力和GSH-Px活力均高于对照组，而用血清中SOD活力显著升高(p〈0. 05)，说明嗜酸乳杆菌活菌体制剂能够显著提高肉鸡血清中SOD活性，从而具有抵抗自由基损伤的作用；试验组GSH-Px活力与对照组相比有所提高，但统计学上无显著性差异(P>0. 05)，可能原因是GSH-Px酶已处于对抗衰老物质不敏感的状态。2. 2肉鸡血清中CAT活力和MDA含量的测定结果表2嗜酸乳杆菌活菌制剂对肉鸡血清中CAT活力、MDA含量的影响
权利要求
1.含嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC No. 5093的饲料添加剂在提高肉鸡抗氧化性能中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂由嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093冻干粉和载体组成。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的载体为脱脂奶粉。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093冻干粉和脱脂奶粉的重量比为1 I. 5 :1 10。
5.如权利要求2 4任ー项所述的应用，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093冻干粉的活菌数为IOici-IO11Cfu/^
6.如权利要求I所述的应用，其特征在于，将所述饲料添加剂添加到肉鸡基础日粮中，使所述嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093的活菌数在基础日粮中达到107cfu/g以上。
全文摘要
本发明公开了含嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC No.5093的饲料添加剂在提高肉鸡抗氧化性能中的应用。本发明提供的嗜酸乳杆菌既对胃肠道环境具有较强的耐受性，由其制备的饲料添加剂添加进肉鸡饲料中后，可升高肉鸡血清中SOD、CAT，GSH-Px活力，降低血清和肝脏中的MDA含量。因此，该菌株可作为饲料添加剂或预混料添加进肉鸡的日粮中，提高肉鸡机体抗氧化性能，改善肉品质，具有广阔的应用前景。
文档编号A23K1/16GK102860419SQ20121035211
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者王凡, 李晓清, 刘婷, 陈丽仙, 王安如 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 浙江大北农农牧科技有限公司, 宿迁大北农饲料有限责任公司