专利名称：一种苦皮藤素母液及其制备方法和质量检测方法
技术领域：
本发明属于植物源农药技术领域，具体地，涉及了一种苦皮藤素母液及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。
背景技术：
植物源农药属生物农药范畴内的一个分支，是用植物中所含的某类稳定成分作为活性成分实施杀虫、杀菌等作用。由于这些活性成分来源于植物本身，易于自然分解；且具有结构的多样性，有害生物难以产生抗药性。因此，植物源农药是今后世界各国绿色农药发展的主要方向之一。国内植物源农药包括除虫菊、苦楝素、苦参碱、烟碱类杀虫剂和苦皮藤素杀虫剂等[①魏艳敏.生物农药及其应用技术问答.中国农业大学出版社2007;②侯太平.植物农药研究进展.中国农业科技导报2006，8 ￠):12]。苦皮藤(CelastrusAngulatus Marim)为卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生落叶藤状灌木植物，又名苦树皮、落霜红、扶芳藤、菜虫药、萝卜药，其根皮粉、叶子粉和茎皮粉在我国民间有着悠久的防治病虫害历史，是我国最有开发潜力的少数杀虫植物之一[卢令娴，等.杀虫植物苦皮藤引种繁殖研究初报.湖北林业科技，1987，3:8]。苦皮藤在我国拥有丰富的自然资源，在河南、陕西、湖北等10多个省丘陵山域均有分布生长[吴文君.杀虫植物苦皮藤研究概况.植物保护，1993，3 (17) :34. J0有关苦皮藤的杀虫活性研究已有较多报道，且已经证实苦皮藤提取物具有杀虫活性强、不易产生抗药性等特点[柯治国，等.杀虫植物——苦皮藤种子的研究.第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集，2004，294.]。已从苦皮藤中分离出多种有效成分，并明确其对昆虫具有拒食、麻醉、毒杀等多样的生物活性，可用来防治蔬菜上的菜青虫、稻苞虫、水稻的粘虫、芫菁叶蜂幼虫、贮粮害虫玉米象等[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用.化学工业出版社，2010.]。目前，苦皮藤素杀虫剂主要液体剂型有1%苦皮藤素乳油[CN94103655. 3 ；1%苦皮藤素乳油正式农药登记证(PD20101574) ]、0· 2%苦皮藤素乳油[CN92113104. 6]、O. 5%苦皮藤素微乳剂[CN99109275. 9]、6%苦皮藤素母液[6%苦皮藤素母液正式农药登记证(PD20101575)]等。文献报道以及现有产品采用的苦皮藤的提取分离方法均为溶剂回流法、渗滤法等传统方法，这些方法耗时费事，提取率低。超声技术作为一种有效的提取方法，已经广泛应用于天然产物的提取研究中[付桂香，等.不同种及不同采收时间沙棘叶中总黄酮的含量测定与比较.中国中药杂志，1997，22 (3) :147 148.]。超声循环技术是在料液循环流动的过程中施加超声波的天然产物提取新技术[郑明昱；郑玲玲；温丽颖；吴英子；郭建鹏；老鹳草鞣质超声循环提取工艺研究中国实验方剂学杂志，2010，16 (12): 7.]，具有提取温度低、提取效率高、提取时间短的独特优势。我们对野生苦皮藤进行了深入、系统的研究[Hai-Lin Qin, et al. ANew Sesquiterpene from Celastrus Angulatus. Chin Chem Lett,1999,10(10) :825-826 ;Hai-Yan Zhang,et al. Two new sesquiterpene polyol estersfrom the root barks of Celastrus angulatus. Journal of asian natural products
4research, 2011, 13 (4) :304.],找到了一系列杀虫活性成分并确定了其化学结构，并经超声循环提取其中的杀虫活性物质，制成绿色农药苦皮藤素母液。苦皮藤的品质不在于某个单一活性成分，其效果是多个活性成分协同配比的结果。研究证明苦皮藤中主要杀虫活性成分是以β_二氢沉香呋喃倍半萜骨架的多元醇酯化合物及其生物碱，统称苦皮藤素。苦皮藤素含有以苦皮素Α、苦皮素B为主的多种杀虫成分。目前，苦皮藤素母液中苦皮藤素组分的检测方法一是测定苦皮藤素母液水解后产生的苯甲酸，操作步骤极其复杂，结果不可靠，可行性差；二是仅对其中一个组分苦皮素A(或苦皮藤素V)进行定量分析[吴文君，等.植物杀虫剂O. 2%苦皮藤素乳油的研究与开发· Pesticides (农药),2001，40(3) : 17.],这种针对单一成分进行定量分析的质量检测模式不能有效控制苦皮藤素母液的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制苦皮藤产品质量的迫切要求。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[罗国安，等.中药指纹图谱的分类和发展.中国新药杂志，2002，11(1) :46. J0目前关于苦皮藤素母液及其水乳剂指纹图谱未见报道。I⑶核磁共振碳谱偶联(I⑶13C NMR coupling)指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药，2000，31 (11):868-870.]的基础上联合其他技术(例如目前应用最广泛的高效液相(HPLC)指纹图谱技术)提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。随着药品、食品安全日益受到国家和社会的高度重视，可广泛应用于无公害蔬菜、农作物和非作物类的害虫防治的苦皮藤素需求量很大，为IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的应用提供了广阔的基础。苦皮藤素母液及其水乳剂IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的研究与应用，不仅可以解决其中活性成分的定性问题，也为加强其内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决植物源农药现有技术、质量等方面存在的问题，本发明的目的在于，提供一种优良的植物源农药苦皮藤素母液及其水乳剂。本发明的另一目的在于，提供一种所述苦皮藤素母液及其水乳剂的制备方法。本发明的又一目的在于，提供一种所述苦皮藤素母液及其水乳剂的质量检测方法。为实现上述目的，本发明提供的一种苦皮藤素母液，其中含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素Al. 9^3. 5%，苦皮素B3. (Γ5. 0%，苦皮素G2. 5^4. 0%，苦皮素E2. 50 4· 10%ο本发明提供的苦皮藤素母液，优选地，其中还含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素C、苦皮藤素II和苦皮素Fl. 2^3. 5%，苦皮藤素IV0. 3^1. 0%，苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素 c (celangulatinC) 3. 0 4· 5%，苦皮素 HO. 3 2. 0%。本发明苦皮藤素母液中的所述活性成分均为4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。S卩，本发明本发明提供的苦皮藤素母液，其中含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素Al. 9 3. 5%，苦皮素B3. 0 5· 0%，苦皮素C、苦皮藤素II和苦皮素Fl. 2 3. 5%，苦皮素G2. 5 4. 0%，苦皮藤素IV0. 3 I. 0%，苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素C (celangulatinC)
3.0 4· 5%,苦皮素 HO. 3 2. 0%。其中，苦皮素C的质量百分含量为O. 35^1. 40%，苦皮素F的质量百分含量为
O.10 0· 90%，苦皮藤素II的质量百分含量为O. 60 1· 21%，苦皮藤素C (celangulatin C)的质量百分含量为O. 3(Γ0. 55%。本发明所述苦皮藤母液中各活性成分(4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)总的质量百分含量不小于10%。进一步地，苦皮藤母液中各活性成分总的质量百分含量为11. 5^18. 5%。更进一步地，品种为河南淅川的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为
16.3^18. 4%，品种为陕西宝鸡的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为11. 7^13. 2%。本发明提供的苦皮藤素母液的制备方法包括称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用体积为5 7倍的苯于45飞5°C下超声循环提取Γ2次，滤液合并后减压浓缩成浸膏，即得苦皮藤素母液。进一步地，苦皮藤根或/和皮粉碎后过1(Γ24目筛，优选24目。进一步地，超声循环提取时，每次提取35 55分钟，优选55分钟。进一步地，超声循环提取的温度优选50°C。进一步地，浓缩的浸膏的密度为I. Γ1. 3。苦皮藤根或/和皮中的活性成分，除了本发明苦皮藤素母液所述的成分外，还包括苦皮素U、X ;苦皮素P、苦皮藤素VII、苦皮藤素XIX;苦皮素J、苦皮藤素III等
4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，以及黄酮、生物碱、三萜等其他类别的成分。本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，包含所述苦皮藤素母液。本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素母液15^20份，乳化剂8 12份，抗冻剂3 4份。其中，所述乳化剂为烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚，优选烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚。其中，所述抗冻剂为乙二醇或丙二醇，优选乙二醇。本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，还包括溶剂。其中，溶剂为水。本发明所述的苦皮藤素水乳剂，其中的辅料，S卩乳化剂、抗冻剂以及溶剂，也可以是本领域的常规种类及用量。还可以使用助剂，也是本领域的常规选择。本发明所述苦皮藤素水乳剂中各活性成分(4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)的总的质量百分含量不小于2%。进一步地，苦皮藤水乳剂中各活性成分总的质量百分含量为2. 3^3. 0%。更进一步地，品种为河南淅川的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为
2.TX 0%，品种为陕西宝鸡的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为2. 3^2. 7%。
本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂的制备方法，包括将所述苦皮藤素母液与乳化剂、抗冻剂和溶剂按所述比例混合，即得。本发明提供的苦皮藤素母液的质量检测方法，包括以下步骤I)对苦皮藤素母液进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素母液特征提取物；2)对苦皮藤素母液特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素母液特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素母液中所述标准参照品的绝对含量；4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素母液中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。其中，步骤I)中，苦皮藤素母液特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤素母液，过滤后在55飞5°C下减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6 10倍量体积、80% 90%的甲醇溶解后，再用3飞倍量体积的石油醚萃取f 2次，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素母液特征提取物。进一步地，用石油醚萃取，每次萃取2(Γ40分钟，优选30分钟。进一步地，苦皮藤素母液过滤后优选在60°C下减压浓缩。苦皮藤素母液特征提取物处理及检测方法如下取苦皮藤素母液特征提取物，溶于CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。其中，步骤2)中，所述苦皮藤素母液特征提取物中的活性成分特征峰为C_15吸收峰，其化学位移为5c60. 0^66. O0进一步地，选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C，其(C-8)化学位移为SJ3. 3^74. 7 ;选择C-Il作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F和苦皮藤素II，其(C-II)化学位移为δ c82. 5^83. 9。其中，步骤2 )中，所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。其中，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤素母液中标准参照品的质量百分含量。其中，所述定量分析手段为高效液相色谱(HPLC)法。进一步地，HPLC法的条件为色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为乙腈:水=(60:40) (55:45)的混合溶剂，流速为lmL/min，检测波长为232nm。乙腈水优选55:45。其中，所述标准参照品为苦皮素A。其中，苦皮藤素母液中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量计算是通过偶联计算公式将IGD核磁共振碳谱和定量分析手段偶联，即步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为
权利要求
1.一种苦皮藤素母液,含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素Al. 9 3. 5%,苦皮素B3. 0 5. 0%，苦皮素G2. 5 4. 0%，苦皮素E2. 50 4. 10% ;所述活性成分均为4-0H- β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
2.根据权利要求I的苦皮藤素母液，其特征在于，其中还含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素C、苦皮藤素II和苦皮素Fl. 2^3. 5%，苦皮藤素IV0. 3^1. 0%，苦皮素Α、苦皮素E和苦皮藤素C3. 0 4· 5%，苦皮素HO. 3 2. 0% ;优选地，其中苦皮素C为O. 35 I. 40%,苦皮素F为O. 10 0· 90%,苦皮藤素II为O. 60 1· 21%，苦皮藤素C为O. 30 0· 55%。
3.根据权利要求I或2所述的苦皮藤素母液，其特征在于，4-ΟΗ-β- 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物总的质量百分含量不小于10% ;优选为11. 5^18. 5%。
4.权利要求Γ3任意一项所述苦皮藤素母液的制备方法，包括称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用体积为5 7倍的苯于45飞5°C下超声循环提取f 2次，每次提取35 55分钟，滤液合并后减压浓缩成浸膏，即得苦皮藤素母液。
5.—种苦皮藤素水乳剂,包含权利要求3任意一项所述的苦皮藤素母液。
6.根据权利要求5所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素母液15 20份，乳化剂8 12份，抗冻剂3 4份。
7.根据权利要求6所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，所述乳化剂为烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚；所述抗冻剂为乙二醇或丙二醇。
8.根据权利要求5 7任意一项所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，该苦皮藤素水乳剂中4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的总的质量百分含量不小于2% ;优选为 2. 3 3. 0%。
9.一种苦皮藤素母液的质量检测方法，包括以下步骤1)对苦皮藤素母液进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素母液特征提取物；2)对苦皮藤素母液特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素母液特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素母液中所述标准参照品的绝对含量；4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素母液中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，所述苦皮藤素母液特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤素母液，过滤后在55飞5°C下减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6 10倍量体积、809Γ90%的甲醇溶解后，再用3飞倍量体积的石油醚萃取广2次，每次萃取2(Γ40分钟，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素母液特征提取物。
11.根据权利要求9或10所述的质量检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述苦皮藤素母液特征提取物中的活性成分特征峰为C-15吸收峰，其化学位移为δ c60. (Γ66. O ;优选地，选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C，C-8的化学位移为δ c73. 3^74. 7 ;选择C-Il作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F和苦皮藤素II，C-II的化学位移为δε82·5 83·9。
12.根据权利要求 Γ I任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤素母液中标准参照品的质量百分含量；所述定量分析手段为高效液相色谱法。
13.根据权利要求扩12任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述标准参照品为苦皮素A。
14.根据权利要求扩13任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为
15.根据权利要求14所述的质量检测方法，其特征在于，计算苦皮藤素母液中各活性成分的系数和总系数的公式为
16. 一种苦皮藤素水乳剂的质量检测方法，利用权利要求9 15任意一项所述方法检测得到苦皮藤素母液中各活性成分的含量，再利用以下公式推算出苦皮藤素水乳剂中各活性成分的质量百分含量=Wn=W1Fn ;其中Wn为苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量；W1为用定量分析手段测定得到的苦皮藤素水乳剂中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；Fn为权利要求15所述的苦皮藤素母液中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数；苦皮藤素水乳剂中活性成分组的含量为各活性成分Wn相加之和；该苦皮藤素水乳剂由苦皮藤素母液制备得到。
全文摘要
本发明涉及一种苦皮藤素母液及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。所述苦皮藤素母液，含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A 1.9~3.5%，苦皮素B 3.0~5.0%，苦皮素G2.5~4.0%，苦皮素E 2.50~4.10%。该苦皮藤素母液采用超声循环提取的方法制备得到，质量检测方法采用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。本发明的苦皮藤素母液含量大幅提高，质量检测方法准确性和稳定性、重复性和可行性也较高。
文档编号A01P7/02GK102907425SQ201210374790
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者赵天增, 张海艳, 董建军, 范毅, 于立芹, 魏悦, 刘雨晴, 郭唯, 常霞, 陈玲, 李倩 申请人:河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司, 河南省生物技术开发中心