专利名称：一种毛柄金钱菌菌株及制备方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及毛柄金钱菌菌株KML-19及制备方法。
背景技术：
毛柄金钱菌veIutipes别名又称毛柄小火燕、构菌、朴燕、冬燕、朴郝、冻菌、金菇、智力菇等，属伞菌目白蘑科金针菇属。毛柄金钱菌营养丰富，清香扑鼻。其菌盖小巧细腻，黄褐色或淡黄色或白嫩。不仅味道鲜美，而且营养丰富，是拌凉菜和火锅食品的原料之一
在毛柄金钱菌栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。毛柄金钱菌菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于毛柄金钱菌的栽培或菌丝体生产。现 有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率较低，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了毛柄金钱菌商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为毛柄金钱菌纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行毛柄金钱菌资源的保护应用不广泛。
发明内容
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地毛柄金钱菌子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备毛柄金钱菌液体及固体优良菌种，为毛柄金钱菌资源保护提供优良菌种
本发明采用的真菌是毛柄金钱菌Flammulina velutipes KML-19 ;保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年10月11日；保藏登记入册的编号CGMCC No. 6704
毛柄金钱菌的子实体由菌盖、菌褶、菌柄三部分组成，多数成束生长，肉质柔软有弹性。菌盖呈球形或呈扁半球形，直径1. 5 7厘米，幼时球形，逐渐平展，过分成熟时边缘皱折向上翻卷。菌盖表面有胶质薄层，湿时有粘性，色黄白到黄褐，菌肉白色，中央厚，边缘薄，菌褶白色或象牙色，较稀疏，长短不一，与菌柄离生或弯生。菌柄中央生，中空圆柱状，稍弯曲，长
3.5 15厘米，直径0. 3 1. 5厘米，菌柄基部相连，上部呈肉质，下部为革质，表面密生黑褐色短绒毛，担孢子生于菌褶子实层上，孢子圆柱形，无色本发明的技术方案
①采集野生毛柄金钱菌子实体；
②组织分离或孢子分离；
③纯化菌株及菌株鉴定；
④生物学特性比较及生产性状比较；
⑤确定优良菌株；
⑥菌种生产及菌种应用；
经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的毛柄金钱菌液体菌种专用菌株KML-19本发明真菌Flammulina velutipes培养方法(以下为重量百分比)
菌种分离纯化培养基2%毛柄金钱菌下脚料、0. 001%VBU2%葡萄糖、2%琼脂；
毛柄金钱菌菌株分离及鉴定方法
1、将毛柄金钱菌子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24°C下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24°C下培养5-7天，获得毛柄金钱菌纯化试管种 3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及 ITS序列测定,通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulinavelutipes) Identities=518/532 (97%), Gaps=8/532 (1%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体
本发明毛柄金钱菌菌种的制备方法分为液体培养和固体培养两种
液体菌种制备方法
液体培养基配方为10 20%麸皮、10 20% 土豆、0. 5 1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH
自然
1、将毛柄金钱菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24°C下培养5-7天，获得试管菌种
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26°C下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5_7天
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0. 8v/(vmin);搅拌转速为120-160r/min ;接种量为5-10% ;罐压0. 04Mpa ； pH为6. 0 ;温度为20-26°C ;通气培养72-96小时，获得毛柄金钱菌液体菌种
固体菌种制备方法
固体培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙l%、pH自然
1、将毛柄金钱菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24°C下培养5-7天，获得试管菌种
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26°C下摇床培养，转速为120-160 r/min，培养时间5_7天
2、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120°C灭菌60分钟，接入液体菌种，于20-26°C培养15-20天，直到菌丝长满
具体实施例方式 实施例一
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18°C下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于18°C下培养7天，获得毛柄金钱菌纯化试管种3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定,通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体
4、将Flammulinavelutipes KML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18°C下培养7天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为10%麸皮、10% 土豆、0. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于20°C下摇床培养，转速为120rpm,培养时间7天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0. 8v/ (vmin)；搅拌转速为120r/min ;接种量为5% ;罐压0. 04Mpa ； pH为6. 0 ;温度为22°C ;通气培养96 小时，获得毛柄金钱菌液体菌种
实施例二
菌种制备的步骤与实施例一相同
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22°C下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22°C下培养6天，获得毛柄金钱菌纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定,通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体
4、将Flammulinavelutipes KML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22°C下培养6天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为15%麸皮、15% 土豆、0.6%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于22°C下摇床培养，转速为140rpm,培养时间6天,获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0. 8v/(vmin)；搅拌转速为140r/min ;接种量为8% ;罐压0. 04Mpa ； pH为6. 0 ;温度为24°C ;通气培养84小时，获得毛柄金钱菌液体菌种
实施例三
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24°C下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24°C下培养5天，获得毛柄金钱菌纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定,通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体
4、将Flammulinavelutipes KML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24°C下培养5天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为20%麸皮、20% 土豆、0. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于26°C下摇床培养，转速为160rpm,培养时间5天,获得一级液体菌种·
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml, 120°C灭菌60分钟后，接种后置于26°C培养15天，获得毛柄金钱菌固体菌种
实施例四
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24°C下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于24°C下培养5天，获得毛柄金钱菌纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定,通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体
4、将Flammulinavelutipes KML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24°C下培养5天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为18%麸皮、10%土豆、1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于26°C下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml, 120°C灭菌60分钟后，接种后置于20°C培养20天，获得毛柄金钱菌固体菌种。
权利要求
1.一种毛柄金钱菌菌株,其特征在于所述菌株为velutipes) KML-19,该菌株的保藏号为CGMCC NO. 6704。
2.根据权利要求1所述的毛柄金钱菌菌株的制备方法，所述菌株是经过常规的液体和固体发酵培养获得的，其特征在于所述液体和固体发酵培养基配方如下 液体培养基配方为5-10%麸皮、O. 5-1%黄豆粉、O. 5-1%麦芽糖、1-3%玉米粉，余下为水，pH自然; 固体培养基配方为木屑75-90%、麸皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生长地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
全文摘要
本发明涉及毛柄金钱菌菌株的筛选及制备方法，属于微生物技术领域。本发明的菌株FlammulinavelutipesKML-19已于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.6704。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于毛柄金钱菌的促繁有着显著的社会、经济效益和广阔的应用前景。
文档编号A01H15/00GK102986536SQ20121050382
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月2日 优先权日2012年12月2日
发明者张微思, 郭永红, 罗孝坤, 罗晓莉, 尚陆娥 申请人:中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所, 云南省供销合作社科学研究所, 昆明菌苑食品有限公司