专利名称：人工创制榨菜细胞质雄性不育系的方法
技术领域：
本发明属于种质资源创新领域，具体涉及一种人工创制榨菜细胞质雄性不育系的方法。
背景技术：
细胞质雄性不育在作物杂种优势利用中有着重要的应用价值。由于细胞质雄性不育不能产生正常的功能花粉，因此，利用雄性不育既可以省去人工去雄的手续，又可以保证杂交一代种子的纯度，同时它又是研究花粉发育、细胞质遗传和核质互作的良好的实验系统。十字花科作物存在着明显的杂种优势，目前杂种一代的生产主要是利用自交不亲和性和雄性不育性两种途径，细胞质雄性不育由于其理论上可以获得100%不育度和不育率的材料，因此，在十字花科作物优势育种利用中有着更广阔的前景，十字花科中许多重要的经 济作物，如白菜、甘蓝、甘蓝型油菜等都选育出了综合性状良好的细胞质雄性不育系。榨菜，统称榨菜，是中国的特产蔬菜，属于十字花科植物，在浙江和四川等地有着广泛的栽培，经济价值大，是重要的加工蔬菜，生产上存在品质下降和病毒病严重等问题，而杂种优势的利用可以改良现有榨菜品种的品质及提高抗性。由于榨菜类作物自交亲和指数非常高，目前没有发现优良自交不亲和系，生产上很难利用自交不亲和系进行杂种优势的利用。迄今为止，在十字花科作物中，在生产上已经应用的细胞质雄性不育系主要有Ougra型的萝卜细胞质雄性不育系、Brassica nap型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系以及Brassica pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系，这些类型的细胞质雄性不育系已经在生产中广泛应用。榨菜类作物细胞质雄性不育创制研究对于榨菜杂种优势的利用具有重要意义，同时对于其他十字花科作物细胞质雄性不育系的人工创制及杂种优势的利用具有借鉴意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人工创制榨菜细胞质雄性不育系的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种榨菜细胞质雄性不育基因orf220，该基因具有SEQ ID NO 3所述的核苷酸序列。备注说明SEQ ID NO 3中的tga(661-663)为终止密码子，不编码氨基酸。本发明还同时提供了上述榨菜细胞质雄性不育基因orf220编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列。本发明还同时提供了上述榨菜细胞质雄性不育基因orf220在线粒体中定位表达的线粒体定位肽，该线粒体定位肽具有SEQ ID N02所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了上述榨菜细胞质雄性不育基因orf220的用途用于创制榨菜细胞质雄性不育系。本发明还同时提供了一种榨菜细胞质雄性不育系的创制方法构建orf220基因线粒体定位表达载体，农杆菌介导的遗传转化方法转化至正常可育榨菜中，获得榨菜细胞质雄性不育系，人工创制的榨菜细胞质雄性不育系特征为(I) orf220基因在线粒体中定位表达；(2)所获得的人工材料表型为雄性不育，雌性可育。作为本发明的榨菜细胞质雄性不育系的创制方法的改进，将PBI121-atp β -orf220的线粒体定位表达载体转入LBA4404农杆菌；通过农杆菌介导转化
至正常可育榨菜，获得转基因植株。本发明还同时提供了 PBI121_atp β _orf220的线粒体定位表达载体的构建方法，包括以下步骤 ①、将含有orf220基因的pUCM-T载体用BamH I和Sac I酶切，回收基因片段，然后连入PBI121表达载体，构建PBI121-orf220载体；②、将含有atp β基因线粒体定位肽的pUCM-T载体用Xba I和BamH I酶切，回收基因片段，然后连入PBI121-orf220载体中，酶切鉴定，构建为PBI121_atp β -orf220的线粒体定位表达载体。SEQ ID NO 1MPQLDKFTYFSQFFWLCLFFFTFYIFICND⑶GVLGISRILKLRNQLLSHRGKTIQSKVRKNRSSDSSRLEVLAFAINYFLFFVIPRLWPYIYIGYGLKFLLGLKYGIFQNEILTLGVGPDGVAPPDINERAPLHLLYADVESSDSQQARNNAMLAHLNRIEYITHDLEGERDIVRRQALIDIMKWEIRSLQQHFRVFRHLDRVRDAQRARMNEILDLFRSEQ ID NO 2MASRRLLASLLRQSAQRGGPISRSLGNSIPKSVSRASSRASPKGFLLNRAVQYATSA具体而言，本发明的技术方案如下基因克隆以榨菜细胞质雄性不育系为材料，播种于温室。提取榨菜细胞质雄性不育系基因组DNA，以其为模板，采用兼并引物，进行常规链式聚合酶反应，扩增产物克隆到pUCM-T载体上，序列测定，得到663 bp的DNA序列，编码220个氨基酸(SEQ ID NO :1，序列表的N01)，定名为orf220。以烟草为材料，提取烟草基因组DNA，根据烟草atp β基因线粒体定位肽，设计引物，进行常规链式聚合酶翻译，扩增产物克隆到PUCM-T载体上，经测序正确。线粒体定位表达载体构建及遗传转化将含有orf220基因的pUCM_T载体用BamH I和Sac I酶切，回收基因片段，然后连入PBI121表达载体，构建PBI121-orf220载体，酶切鉴定。将含有atp β基因线粒体定位肽的PUCM-T载体用Xba I和BamH I酶切，回收基因片段，然后连入PBI121-orf220载体中(图1)，酶切鉴定，再转入LBA4404农杆菌。所构建的线粒体定位表达载体通过GFP融合蛋白鉴定(图2)。表达载体鉴定正确后，通过农杆菌介导转化至正常可育榨菜，获得转基因植株。本发明还提供了含有上述榨菜细胞质雄性不育基因orf220的转基因株系的培育方法将上述线粒体定位表达载体转入LBA4404农杆菌，通过农杆菌介导转化至正常可育榨菜(转基因方法见具体实施方案)，从而获得转基因植株。本发明还提供了含有上述榨菜orf220基因的雄性不育榨菜雄性不育功能鉴定转基因株系及正常可育榨菜播种于可控温室中，至开花期观察性状，并分别进行套袋自交和正常花粉授粉实验，转基因株系自交无种子产生，正常可育花粉人工授粉可以产生种子(图4-C)，说明转基因株系为雄性不育，而雌性可育，并出现类似细胞质雄性不育的表型(图4-A，B，D)。综上所述，本发明首次克隆榨菜orf220基因，并且通过构建orf220基因的线粒体定位表达载体，农杆菌介导遗传转化至正常可育榨菜证实orf220基因的的功能,人工创制榨菜胞质雄性不育系。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是orf220基因线粒体定位表达载体结构图；图2是orf220基因线粒体定位表达检测图；图3是榨菜转基因再生体系图；左上图为再生芽分化，右上图为再生芽生长，左下图为再生芽生根，右下图为再生苗移栽；图4是转基因株系花发育及育性情况；A为野生型与转基因植株，B为野生型与转基因植株花蕾，C为野生型与转基因植株荚果，D为野生型与转基因植株花形态；图4中，Wild type为正常可育榨菜，mt-ex_orf220为转基因榨菜；WT_SP为正常可育自交。T-SP为转基因自交，T-CP为转基因正常花粉授粉。
具体实施例方式实施例1、基因的犾得以榨菜细胞质雄性不育系为材料，播种于温室。提取榨菜细胞质雄性不育系基因组DNA,以其为模板,根据Genebank公共数据库中nap类型甘蓝型油菜(Brassica nap)细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜(Brassica pol)细胞质雄性不育相关基因orf224设计兼并引物，进行常规链式聚合酶反应，扩增产物克隆到pUCM-T载体上，序列测定，得到663 bp的DNA序列。具体如下(I)引物设计根据Genebank数据库中nap类型甘蓝型油菜(Brassica nap)细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜(Brassica pol)细胞质雄性不育相关基因 orf224 设计兼并引物(orf222 基因 Genebank 登录号U10423，orf224 基因 Genebank登录号S46795,均可以在http://www. ncb1. nlm. nih. gov/中查找到)设计兼并引物。上述克隆方法所述的兼并引物是正向引物5’_TACGGATCCATGCCTCAACTGGAT -3’反向引物5’_AGAGAGCTCATCGAAATAGATC -3’(2 ) CTAB法提取植物总DNA方法(a)取O. 5g榨菜(浙桐3号)嫩叶于研钵中，液氮状态下研磨,加入600 ul 65V预热的2 X CTAB (用前加入0. 2%的巯基乙醇，即加入30 μ I的巯基乙醇)，转移到离心管中，65°C保温I小时。(b)加入600 Ul酚-氯仿-异戊醇的混合液(酚氯仿异戊醇=25:24:1的体积比)轻轻摇勻，4°C, 13000rpm离心，10分钟。(C)将步骤(b)所得的上清液转入一新离心管中，加入600ul氯仿-异戊醇(氯仿异戍醇=24:1),轻轻混勻，4°C, 13000rpm离心，10分钟。(d)取步骤(C)所得的上清于另一离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置5分钟，13000rpm,离心10分钟。(e)倒去上清，加入700 ul Wash Buffer漂洗DNA沉淀，离心(13000rpm,离心10分钟)；再重复一次上述的倒去上清、漂洗和离心。(f)加 15 微升 TE-Rnase，37 °C 保温 I 小时。
(g)加入 2 mol/L NaCl 100 ul + 100 % 乙醇 250 ul 混匀，-20 °C静置 30min，13000rpm离心10分钟。(h)倒去上清，加入500 ul 70 % (体积浓度)乙醇漂洗，倒去漂洗后的70 %乙醇；重复漂洗一次，倒去漂洗后的70%的乙醇，常温晾干。(i)加入30 50 ul ddH20或TE，回溶，_20°C保存备用。作为模板。注2XCTAB配方，IOOml体系包括
CTAB2g
Tris-Hcl (pH8—O); IOml EDTA0.74 g
NaCl58,182gt
PVP3 ,Og按上述质量/体积混合5种成分后，定容至IOOml。TE-RNase: 15 ul TE 加入 1/100 体积(即 O. 15 ul)的 RNase ；Wash Buffer:在76 % (体积浓度)乙醇中加入乙酸氨，直至乙酸氨的浓度为10mmol /I,η(3)链式聚合酶反应(PCR)的试剂与条件首先将下列试剂混和在一起
!OxTaq DNA聚合_缓冲液 5 Il升(μ1)
模板DNAI μ
正向切物(1'25μ§/1)0.4 μ
反向引物(1.25μ§/1)0.4 μ
ft’C核_f 酸浞介物(dNTP, 2.5mMeach) I μ 聚 pi0,4
灭菌水41.8 μ
总体枳50 μ
PCR反应条件将上述混和液94°C变性3分钟，然后进入以下循环94°C变性30秒，50°C退火45秒，72°C延伸I分钟，35个循环后72°C延伸10分钟，结果扩增到663的一条带。(4) Orf22O 基因的克隆(a)连接反应，离心管顺序加入以下各组分
权利要求
1.榨菜细胞质雄性不育基因orf220，其特征是该基因具有SEQID NO 3所述的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的榨菜细胞质雄性不育基因orf220编码的蛋白质，其特征是该蛋白质具有SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列。
3.如权利要求1所述的榨菜细胞质雄性不育基因orf220在线粒体中定位表达的线粒体定位肽，其特征是该线粒体定位肽具有SEQ ID N02所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的榨菜细胞质雄性不育基因orf220的用途，其特征是用于创制榨菜细胞质雄性不育系。
5.榨菜细胞质雄性不育系的创制方法，其特征是构建orf220基因线粒体定位表达载体，农杆菌介导的遗传转化方法转化至正常可育榨菜中，获得榨菜细胞质雄性不育系，人工创制的榨菜细胞质雄性不育系特征为Cl) orf220基因在线粒体中定位表达；(2)所获得的人工材料表型为雄性不育，雌性可育。
6.根据权利要求5所述的榨菜细胞质雄性不育系的创制方法，其特征是将PBI121-atp β -orf220的线粒体定位表达载体转入LBA4404农杆菌；通过农杆菌介导转化至正常可育榨菜，获得转基因植株。
7.PBI121-atp^-orf220的线粒体定位表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤①、将含有orf220基因的pUCM-T载体用BamHI和Sac I酶切，回收基因片段，然后连入PBI121表达载体，构建PBI121-orf220载体；②、将含有atpβ基因线粒体定位肽的pUCM-T载体用Xba I和BamH I酶切，回收基因片段，然后连入PBI121-orf220载体中，酶切鉴定，构建为PBI121_atp β -orf220的线粒体定位表达载体。
全文摘要
本发明公开了一种榨菜细胞质雄性不育系的创制方法，构建orf220基因线粒体定位表达载体，农杆菌介导的遗传转化方法转化至正常可育榨菜中，获得榨菜细胞质雄性不育系，人工创制的榨菜细胞质雄性不育系特征为(1) orf220基因在线粒体中定位表达；(2) 所获得的人工材料表型为雄性不育，雌性可育。榨菜细胞质雄性不育系的创制方法，具体为将PBI121-atpβ-orf220的线粒体定位表达载体转入LBA4404农杆菌；通过农杆菌介导转化至正常可育榨菜，获得转基因植株。
文档编号A01H5/00GK103014020SQ20121054138
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者杨景华, 张明方 申请人:浙江大学