专利名称：用于降解脐橙囊衣微生物的培养基及酶制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种用于降解脐橙囊衣微生物的培养基及酶制剂的制备方法。
背景技术：
我国柑橘加工长期沿袭着人工剥皮和酸碱脱囊衣等传统工艺生产。现有酸碱法脱囊衣的酸碱处理法主要有经典酸碱二步法、改良重酸二步法、磷酸盐NaOH —步法，以及EDTA或Na2-EDTA (乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠)为助剂的低碱去囊衣法。人工去皮和酸碱脱囊衣工艺存在劳动密集、生产效率低、产品质量不稳定等问题。目前工业化罐头生产脱囊衣耗水量大，每吨产品耗水量达60 80吨，不仅增加产品成本，而且加剧了饮用水 资源的短缺。同时，因大量使用碱，产生大量的工业碱液废水，增加了产品的生产成本，也污染环境，影响了产品的安全性，容易遭遇技术壁垒和绿色壁垒，削弱了我国柑橘罐头工业在国际市场的竞争优势。同时，在柑橘加工生产中产生了约占柑橘加工量30%左右的皮渣，通常都被丢弃掉，不仅造成资源浪费，也给环境带来了污染。脐橙加工中脱囊衣工艺是其主要技术难点之一。目前橙汁胞的生产技术主要采用传统柑橘罐头酸碱处理的工艺，存在人工剥皮、分瓣，生产效率低；酸碱囊衣用水量大，环境污染严重，产品安全性低；由于柑橘皮与脐橙皮结构的差异，导致现有的柑橘酶法去囊衣技术不适合于脐橙橙汁胞的加工。
发明内容
本发明旨在提供一种用于降解脐橙囊衣微生物的培养基及酶制剂的制备方法，以高效地制备降解脐橙囊衣微生物的酶制剂。根据本发明的一个发明，提供一种降解脐橙囊衣酶制剂的制备方法。该制备方法包括采用保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:M 2012160的黑曲霉C-2 (Aspergillus sp. C_2)作为发酵菌株，经过液体深层发酵或固态发酵培养制备得到降解脐橙囊衣酶制剂。进一步地，液体深层发酵或固态发酵培养之前进一步包括活化、制备孢子悬浮液、种子培养的步骤。进一步地，活化包括将黑曲霉C-2接种于活化培养基中进行活化，活化培养基的pH值为7. 0 7. 2，活化温度控制在28°C 30°C，活化时间为I 2天；其中，活化培养基为以脐橙囊衣粉为碳源的固体斜面培养基，包括如下含量的组分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/UMgSO4 0. 6g/L Ig/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉 6g/L IOg/L和琼脂15g/L 20g/L，并且在121°C温度下灭菌30min制得活化培养基。进一步地，制备孢子悬浮液的步骤包括采用无菌水洗下黑曲霉C-2的孢子，并稀释至2 3X IO6个/mL制得孢子悬浮液，并将孢子悬浮液保存在4°C备用。进一步地，种子培养包括将孢子悬浮液接种于种子液体培养基中，控制种子液体培养基的pH值为7. O 7. 2，培养温度控制在28°C 30°C，200r/m培养12 16h ;或将孢子悬浮液接种于种子固体培养基中，控制种子固体培养基的初始PH值为6. 5，培养温度控制在28V 30°C，培养48h ;其中，种子液体培养基为以脐橙囊衣粉为碳源的培养基，包括如下含量的组分=(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C温度下灭菌30min制得种子液体培养基。进一步地，液体深层发酵培养的步骤包括将经过种子培养的含黑曲霉C-2的种子液体培养基接种于发酵瓶中进行深层发酵培养，发酵培养条件为12h内温度为30°C，12h 后 28°C ；pH 值为 7. 0 7. 2 ;压力位 0. 06MPa 0. 08MPa ;搅拌速度 12h 内 180r/m, 12h后200r/m ;通气量1:1. 0 1. 5 ;发酵时间108 120h,制得酶制剂。进一步地，固态发酵培养的步骤包括经过种子培养的含黑曲霉c-2的种子固体培养基接种入固态发酵培养基中，30°C培养108h，得到黑曲霉C-2固态发酵曲，固态发酵曲通过低温干燥及粉碎后制得酶制剂，或通过0. 5mol/L pH=6. 5磷酸缓冲液中浸提获得酶制剂；其中，固态发酵培养基通过以下方法制备将麦麸95重量份、脐橙果渣或脐橙果皮粉180重量份、硫酸铵2重量份、硫酸镁0. 5重量份、磷酸氢二钾I重量份加入水拌匀并调节水分湿度为60%，得固态发酵培养基。进一步地，包括将酶制剂经过超滤、浓缩制得浓缩酶制剂，或将酶制剂制备成粉剂或颗粒剂。根据本发明的另一个方面，提供一种用于降解脐橙囊衣微生物的培养基，培养基为以脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣为碳源。进一步地，包括如下含量的组分(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L Ig/L^K2HPO4lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉 6g/L 10g/L 和琼脂 15g/L 20g/L，并且在121°C温度下灭菌30min制得培养基。进一步地，包括如下含量的组分(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L Ig/ L、K2HPO4lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C温度下灭菌30min制得培养基。采用本发明的技术方案，以脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣为碳源的培养基对本发明中的微生物(保藏号为CCTCCN0:M 2012160，保藏日为2012年5月7日)进行培养制备酶制剂，制得的酶制剂不仅降解脐橙囊衣效果明显，还利用脐橙果渣发酵产酶，变废为宝，既提高了脐橙产业的附加值，有保护了环境，具有经济和社会双重意义。
具体实施例方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种降解脐橙囊衣微生物。该微生物的保藏名称为黑曲霉C-2(Aspergillus sp. C-2)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:M 2012160，保藏日为2012年5月7日。本发明的降解脐橙囊衣微生物是通过以下步骤筛选获得的从腐烂脐橙表面、土壤等样品中筛选目标菌株，然后经过紫外诱变后，通过反复的筛选获得对脐橙囊衣具有高效降解作用的菌株。本发明的准用菌株经鉴定为黑曲霉C-2 (Aspergillus sp.C-2)，其主要生物学特征为在固体培养基上，培养3d 5d，菌落蔓延迅速，初为白色，后变成褐色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状，直径2. 5 4. O Pm。分生孢子头球状，直径700 800 ym，褐黑色。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。分生孢子梗自基质中伸出长约I 3mm,壁厚而光滑。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种降解脐橙囊衣酶制剂。该酶制剂采用上述降解脐橙囊衣微生物制得。由于该降解脐橙囊衣酶制剂不涉及酸碱的大量使用，通过生物酶解作用进行脐橙囊衣的脱除，因此可大大提升生产效率、减少脐橙果破碎率、使产品质量稳定，并且能够降低生产成本，无残留、绿色环保、安全性高、不污染环境。优选地，该酶制剂采用上述降解脐橙囊衣微生物经液体深层发酵或固态发酵培养制得。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种降解脐橙囊衣酶制剂的制备方法。该 制备方法包括采用上述黑曲霉C-2作为发酵菌株，经过液体深层发酵或固态发酵培养制备得到降解脐橙囊衣酶制剂。在脐橙囊衣的脱除过程中起主要作用的是该黑曲霉C-2及其代谢物，因为此制备也可以采用现有技术中的常规方法进行，优选地，黑曲霉C-2经过液体深层发酵或固态发酵培养制备得到降解脐橙囊衣酶制剂，因为这些酶制剂的制备方法简单，便于工业化生产，而且不会造成环境污染。优选地，液体深层发酵或固态发酵培养之前进一步包括活化、制备孢子悬浮液、种子培养的步骤，增加这些步骤可以使菌株的活性增强，有利于酶制剂的生产效率提高，以及在后续使用过程中使酶制剂保持较高的活性。根据本发明一种典型的实施方式，活化包括将黑曲霉C-2接种于培养基中进行活化，培养基的PH值为7. 0 7. 2，活化温度控制在28°C 30°C，活化时间为I 2天。冷冻保藏的产酶黑曲霉C-2菌种细胞通过该活化程序，可使该微生物产酶的能力快速恢复正
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巾o根据本发明一种典型的实施方式，种子培养包括将活化的孢子悬浮液接种于种子液体培养基中，控制种子液体培养基的PH值为7. 0 7. 2，培养温度控制在28°C 30°C，200r/m培养12 16h，最终获取一定数量和质量的纯种子，可作为大规模发酵生产的菌种。根据本发明一种典型的实施方式，液体深层发酵培养包括将经过种子培养的含黑曲霉C-2的种子液体培养基接种于发酵瓶中进行深层发酵培养，发酵培养条件为12h内温度为300C，12h 后 280C ；pH 值为 7. 0 7. 2 ;压力位 0. 06MPa 0. 08MPa ;搅拌速度 12h 内 180r/m，12h后200r/m ;通气量1:1. 0 1. 5 ;发酵时间108 120h,制得酶制剂。通过液体深层发酵能够保证养分均匀分配和氧气充足，具有发酵产酶生产周期短、产量高、效益大等优点。根据本发明一种典型的实施方式，固态发酵培养的步骤包括经过所述种子培养的含黑曲霉C-2的所述种子固体培养基接种入固态发酵培养基中，30°C培养108h，得到黑曲霉C-2固态发酵曲，所述固态发酵曲通过低温干燥及粉碎后制得所述酶制剂，或通过0. 5mol/L pH=6. 5磷酸缓冲液中浸提获得所述酶制剂。固态发酵模拟菌种自然生长环境，使微生物保持与自然界相似的生长状态，发酵结束时，培养基是湿物料状态，目的产物浓度高且提取工艺简单。根据本发明一种典型的实施方式，活化用的培养基为固体斜面培养基；制备孢子悬浮液的步骤包括采用无菌水洗下黑曲霉C-2的孢子，并稀释至2 3X IO6个/mL制得孢子悬浮液，并将孢子悬浮液保存在4°C备用。优选地，种子培养步骤中将孢子悬浮液按5%的接种量接种于种子液体培养基中；液体深层发酵培养步骤中将经过种子培养的含黑曲霉C-2的种子液体培养基按8% 10%的接种量接种于发酵瓶中进行深层发酵培养。此接种量既不会造成菌种的浪费，又有利于黑曲霉C-2的快速繁衍。优选地，活化用的以脐橙囊衣粉为碳源的培养基包括如下含量的组分=(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉6g/L 10g/L和琼脂15g/L 20g/L，并且活化用的培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种活化培养基适合用于黑曲霉C-2的活化，因为以脐橙囊衣粉为碳源，冷冻保藏的产酶黑曲霉C-2菌种细胞通过该活化程序，可使该微生物产生脐橙囊衣降解 酶的能力快速恢复正常。优选地，种子液体培养用的以脐橙囊衣粉为碳源的培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且种子液体培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种种子液体培养基适合用于黑曲霉C-2的培养，最终获取一定数量和质量的纯种子，可作为大规模发酵生产的菌种。并且液体深层发酵培养的过程中也可以采用此培养基进行。因为以脐橙囊衣粉为碳源，可使该微生物产生的脐橙囊衣降解酶保持高活力。根据本发明一种典型的实施方式，步骤4)之后根据实际需要进一步包括将酶制剂经过超滤、浓缩制得浓缩酶制剂，或将酶制剂制备成粉剂或颗粒剂等，浓缩酶制剂方便使用，粉剂或颗粒剂等更便于保藏与运输。通过本发明方法制备的酶制剂酶解效率较高；并且经过该方法制得的酶制剂在酶发酵液经过过滤除菌、超滤浓缩、防腐处理后室温保存6个月后酶活仍然保持95%以上。根据本发明一种典型的实施方式，上述降解脐橙囊衣酶制剂在脐橙、柑橘脱囊衣上的应用。优选地，酶制剂的应用包括以下步骤酶制剂稀释后与削皮脐橙于45 50°C水浴保温90 120min。根据本发明一种典型的实施方式，降解脐橙囊衣的具体方法为将削皮残留囊衣的脐橙果球备用，将浓缩的发酵酶制剂以5% 8%的浓度稀释后搅拌均匀，夹层锅汽浴升温到45 °C，然后加入削皮的脐橙(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4. 5，在温度45 50°C条件下，不断搅拌并保持恒温90 120min，得到脱囊衣脐橙果球，果球经过分散机处理后的到橙汁胞，该酶制剂可以在上述条件下重复使用3 5次。本发明在对降解脐橙囊衣微生物菌株选育的同时对其发酵产酶的工艺进行了优化，适合工业化大规模生产该酶制剂。根据本发明的一种典型的实施方式，提供一种用于降解脐橙囊衣微生物的培养基。该培养基为以脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣为碳源。用作微生物活化时，优选地包括如下含量的组分(NH4) 2S04 2g/L 2. 5g/L、MgS04
0.6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉 6g/L lOg/L 和琼脂15g/L 20g/L，并且在121°C温度下灭菌30min制得所述培养基。用于种子液态培养时，优选地包括如下含量的组分。(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C温度下灭菌30min制得所述培养基。下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。活化培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L Ig/UK2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉 6g/L 10g/L 和琼脂 15g/L 20g/L，并且活化用的培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种活化培养基适合用于黑曲霉C-2的活化。上述组分范围内的培养基效果相似。种子液体培养基包括如下含量的组分(NH4) 2S04 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣 15g/L 20g/L ；并且种子液体培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种种子液体培养基适合用于黑曲霉C-2的培养，并且液体深层发酵培养的过程中也可以采用此培养基进行。
实施例1本实施例考察液体深层发酵液中本发明的黑曲霉C-2菌株CCTCCN0:M 2012160发酵液对脐橙囊衣的降解。采用以下方法制备一种本发明的黑曲霉C-2菌株的酶制剂活化培养基包括如下含量的组分=(NH4)2SO42g/L、MgSO4 0. 6g/L、K2HPO4 lg/L、NaCl lg/L、脐橙囊衣粉6g/L和琼脂15g/L，并且活化用的培养基在121 °C温度下灭菌30min制得。此种活化培养基适合用于黑曲霉C-2的活化。上述组分范围内的培养基效果相似。种子液体培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0. 6g/L、K2HPO4 lg/L、NaCl lg/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L ;并且种子液体培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种种子液体培养基适合用于黑曲霉C-2的培养，并且液体深层发酵培养的过程中也可以采用此培养基进行。步骤如下(I)活化将所述选育得到的黑曲霉C-2种子接种于新鲜的固体斜面培养基中进行活化，所述活化过程中，控制固体斜面培养基的PH值为7. 0 7. 2，活化温度控制在28°C 29°C，活化培养2 3天，用无菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制备孢子悬浮液并稀释至2 3X IO6个/mL，并将其保存在4°C备用；(2)种子培养将上述活化后的黑曲霉C-2孢子悬浮液按5%接种量接种于种子液体培养基中，控制种子培养基的pH值为7. 0 7. 2，种子培养时的温度控制在28°C 30°C，200r/m培养12 16h ;培养基中脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L。(3)液体深层发酵培养将上述培养后的种子黑曲霉C-2菌种按液体深层发酵培养基8% 10%的接种量接种入发酵瓶中进行深层发酵培养，所述液体深层发酵培养基的配方与所述种子液体培养基相同，发酵培养条件为12h内温度为30°C，12h后28°C ；自动调节 pH 7. 0 7. 2 ;罐压 0. 06MPa 0. 08MPa ;搅拌速度 12h 内 180r/m，12h 后 200r/m ;通气量1:1. 0 1. 5 ;发酵时间108 120h。全流程培养时间大约在10天，将液体深层发酵所得的酶液立即使用，将所述发酵所得到的酶液经过超滤浓缩得到浓缩酶液，或通过其他加工方式得到的不同的降解脐橙囊衣酶制剂，如粉剂或颗粒剂等，备用。脐橙50kg，经过削皮机两端打孔及削皮后，得到约40kg含囊衣的脐橙果球，备用。将浓缩的发酵酶制剂以5% 8%的浓度稀释后搅拌均匀，夹层锅汽浴升温到40°C，然后加入削皮的脐橙(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4. 5，在温度45 50°C条件下，不断搅拌并保持恒温90 120min，得到脱囊衣脐橙果球，果球经过分散机处理后的到橙汁胞，该酶制剂可以在上述条件下重复使用3 5次。实施例2本实施例考察液体深层发酵液中本发明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160发酵液对脐橙囊衣的降解。采用以下方法制备一种本发明的黑曲霉C-2菌株的酶制剂活化培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO42. 5g/L, MgSO4 lg/L、K2HPO4 2g/L、NaC12g/L、脐橙囊衣粉10g/L和琼脂20g/L，并且活化用的培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种活化培养基适合用于黑曲霉C-2的活化。上述组分范围内的培养基效果相似。种子液体培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO4 2. 5g/L、MgSO4 lg/L、K2HPO4 2g/L、2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣20g/L ;并且种子液体培养基在121°C温度下灭菌30min 制得。此种种子液体培养基适合用于黑曲霉C-2的培养，并且液体深层发酵培养的过程中也可以采用此培养基进行。步骤如下(I)活化将所述选育得到的黑曲霉C-2种子接种于新鲜的固体斜面培养基中进行活化，所述活化过程中，控制固体斜面培养基的PH值为7. 0 7. 2，活化温度控制在29°C 30°C，活化培养2 3天，用无菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制备孢子悬浮液并稀释至2 3X IO6个/mL，并将其保存在4°C备用；(2)种子培养将上述活化后的黑曲霉C-2孢子悬浮液按5%接种量接种于种子液体培养基中，控制种子培养基的pH值为7. 0 7. 2，种子培养时的温度控制在28°C 30°C，200r/m培养12 16h ;培养基中脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣20g/L。(3)液体深层发酵培养将上述培养后的种子黑曲霉C-2菌种按液体深层发酵培养基8% 10%的接种量接种入发酵瓶中进行深层发酵培养，所述液体深层发酵培养基的配方与所述种子液体培养基相同，发酵培养条件为12h内温度为30°C，12h后28°C ；自动调节 pH 7. 0 7. 2 ;罐压 0. 06MPa 0. 08MPa ;搅拌速度 12h 内 180r/m，12h 后 200r/m ;通气量1:1. 0 1. 5 ;发酵时间108 120h。全流程培养时间大约在10天，将液体深层发酵所得的酶液立即使用，将所述发酵所得到的酶液经过超滤浓缩得到浓缩酶液，或通过其他加工方式得到的不同的降解脐橙囊衣酶制剂，如粉剂或颗粒剂等，备用。脐橙50kg，经过削皮机两端打孔及削皮后，得到约40kg含囊衣的脐橙果球，备用。将浓缩的发酵酶制剂以5% 8%的浓度稀释后搅拌均匀，夹层锅汽浴升温到40°C，然后加入削皮的脐橙(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4. 5，在温度45 50°C条件下，不断搅拌并保持恒温90 120min，得到脱囊衣脐橙果球，果球经过分散机处理后的到橙汁胞，该酶制剂可以在上述条件下重复使用3 5次。实施例3本实施例考察固态发酵中本发明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160固态发酵曲对脐橙囊衣的降解。采用以下方法制备一种本发明的黑曲霉C-2固体曲活化培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO42. 3g/L、MgSO4 0. 8g/L、K2HPO41. 5g/L、NaCl1. 5g/L、脐橙囊衣粉8g/L和琼脂18g/L，并且活化用的培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种活化培养基适合用于黑曲霉C-2的活化。上述组分范围内的培养基效果相似。种子液体培养基包括如下含量的组分(NH4)2SO4 2. 3g/L、MgSO4 0. 8g/L、K2HPO41.5g/L、NaCl1. 5g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣18g/L ;并且种子液体培养基在121°C温度下灭菌30min制得。此种种子液体培养基适合用于黑曲霉C-2的培养，并且液体深层发酵培养的过程中也可以采用此培养基进行。步骤如下(I)活化将所述选育得到的黑曲霉C-2种子接种于新鲜的固体斜面培养基中进行活化，所述活化过程中，控制固体斜面培养基的PH值为7. 0 7. 2，活化温度控制在28°C 30°C，活化培养2 3天，用无菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制备孢子悬浮液并稀释至2 3X IO6个/mL，并将其保存在4°C备用；(2)种子培养将上述活化后的黑曲霉C-2孢子悬浮液按5%接种量接种于灭菌的由麦麦麸95重量份、脐橙果渣或果皮粉180重量份、硫酸铵2重量份、硫酸镁0. 5重量份、磷酸氢二钾I重量份，以上各组分加入水拌匀并调节水分湿度为60%。(初始pH 6. 5)，30°C培养48h。 (3)固态发酵培养将上述活化的黑曲霉C-2种子曲按10%接种量接入50kg固态发酵培养基中，所述固态发酵培养基各组分与上述固态种子培养基组分相同，种子曲与固态发酵培养基混合均匀后，30°C培养108h，得到黑曲霉C-2固态发酵曲，该固态发酵曲可以通过低温干燥及粉碎后使用，也可通过0. 5mol/L pH=6. 5磷酸缓冲液中浸提获得液体酶液后使用。脐橙50kg，经过削皮机两端打孔及削皮后，得到约40kg含囊衣的脐橙果球，备用。将上述低温干燥、粉碎的黑曲霉C-2固态发酵曲12kg加入120kg的生理盐水中，搅拌均匀，夹层锅汽浴升温到40°C，然后加入削皮的脐橙(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4. 5，在温度45 50°C条件下，不断搅拌并保持恒温90 120min，得到脱囊衣脐橙果球，果球经过分散机处理后的到橙汁胞，该黑曲霉C-2固态发酵曲可以在上述条件下重复使用3 5次。实施例4本实施例考察液体深层发酵液中本发明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160发酵液对柑橘囊衣的降解。采用以下方法制备一种本发明的黑曲霉C-2菌株的酶制剂制备过程同实施例1。雪峰蜜桔50kg，经过洗涤、热汤后剥皮，分瓣并清除橘瓣上的脉络，得到橘瓣约35kg备用。将浓缩的发酵酶制剂以5% 8%的浓度稀释后搅拌均匀，夹层锅汽浴升温到400C，然后加入35kg去皮除脉络橘瓣(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4. 5，在温度40 45°C条件下，不断搅拌并保持恒温90 lOOmin，得到全脱囊衣橘瓣，内胞破碎率低，并且保持了柑橘原有的风味及色泽。该酶制剂可以在上述条件下重复使用3 5次。对比例在本对比例中采用的是传统的真菌培养基，考察液体深层发酵液中本发明的黑曲霉C-2菌株CCTCC NO:M 2012160发酵液对脐橙囊衣的降解效果。传统的真菌培养基配方称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOmL煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖(活化15g琼脂)，充分溶解后趁热纱布过滤，分装后121°C灭菌20分钟。采用传统的真菌培养基配方制备本发明的黑曲霉C-2菌株的酶制剂的步骤与方法与实施例1相同。
脐橙100kg，经过削皮机两端打孔及削皮后，得到约80kg含囊衣的脐橙果球，平均分为两份备用。分别将不同培养基发酵浓缩得到的发酵酶制剂以5% 8%的浓度稀释后搅拌均匀，夹层锅汽浴升温到40°C，然后加入削皮的脐橙(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4. 5，在温度45 50°C条件下，不断搅拌并保持恒温90 120min。通过实施例1到4及对比例的实验结果可以看出，通过传统的真菌培养基配方发酵液对脐橙囊衣的没有观察到降解效果，而通过本发明所提供的培养基配方发酵液处理得到全脱囊衣的脐橙果球。通过对比试验发现本发明培养基配方不仅降解脐橙囊衣效果明显，还利用脐橙果渣发酵产酶，变废为宝，既提高了脐橙产业的附加值，有保护了环境，具有经济和社会双重意义。综上，与现有技术相比，本发明的优点在于
1、本发明的降解脐橙囊衣微生物酶制剂可工业化大规模生产，经过除菌、防腐及浓缩处理后，酶制剂在常温保存6个月其酶活性保持95%以上，使用方便，生产成本低。2、该酶制剂对脐橙囊衣降解作用高效、完全，彻底分解，且不损伤内部橙汁胞，提高生产效率，降低劳动强度，降低生产成本。3、本发明与酸碱工艺相比，生物酶制剂降解囊衣后的营养成分被破坏及流失优于传统的酸碱法，其保持了脐橙原有的风味及色泽。4、避免了传统酸碱工艺造成的重金属等有害物质的残留的食品质量安全技术壁垒和酸碱排放造成的环境污染，节约大量的水资源，实现了经济效益、生态效益及社会效益的统一。5、本发明培养基配方不仅降解脐橙囊衣效果明显，还利用脐橙果渣发酵产酶，变废为宝，既提高了脐橙产业的附加值，有保护了环境，具有经济和社会双重意义。总体来说，本发明的黑曲霉C-2菌株及其发酵产酶具有生产成本小、使用方便、脐橙囊衣降解效果好等优点，适合在全国柑橘生产企业大范围推广使用。本发明对于保护生态环境，提升食品质量安全，保持脐橙原有风味，促进脐橙精深加工发展等方面具有重要意义。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种降解脐橙囊衣酶制剂的制备方法，其特征在于，采用保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2012160的黑曲霉c-2作为发酵菌株，经过液体深层发酵或固态发酵培养制备得到所述降解脐橙囊衣酶制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体深层发酵或固态发酵培养之前进一步包括活化、制备孢子悬浮液、种子培养的步骤。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述活化包括将所述黑曲霉C-2接种于活化培养基中进行活化，所述活化培养基的pH值为7. O 7. 2，活化温度控制在28°C 30°C，活化时间为I 2天；其中，所述活化培养基为以脐橙囊衣粉为碳源的固体斜面培养基，包括如下含量的组分=(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgSO4 O. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉6g/L 10g/L和琼脂15g/L 20g/L，并且灭菌制得所述活化培养基。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备孢子悬浮液的步骤包括采用无菌水洗下所述黑曲霉C-2的孢子，并稀释至2 3 X IO6个/mL制得孢子悬浮液，并将所述孢子悬浮液保存备用。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养包括将所述孢子悬浮液接种于种子液体培养基中，控制所述种子液体培养基的PH值为7.O 7. 2，培养温度控制在28°C 30°C，200r/m培养12 16h ;或将所述孢子悬浮液接种于种子固体培养基中，控制所述种子固体培养基的初始PH值为6. 5，培养温度控制在28°C 30°C，培养24 48h ；其中，所述种子液体培养基为以脐橙囊衣粉为碳源的培养基，包括如下含量的组分 (NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 O. 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、 脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C温度下灭菌30min制得所述种子液体培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体深层发酵培养的步骤包括 将经过所述种子培养的含黑曲霉C-2的所述种子液体培养基接种于发酵瓶中进行液体深层发酵培养，液体深层发酵培养基同所述种子液体培养基，发酵培养条件为12h内温度为30°C，12h后28°C ;pH值为7· O 7· 2 ;压力位O. 06MPa O. 08MPa ;搅拌速度12h内 180r/m, 12h后200r/m ;通气量1:1. O 1. 5 ;发酵时间108 120h,制得所述酶制剂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固态发酵培养的步骤包括经过所述种子培养的含黑曲霉C-2的所述种子固体培养基接种入固态发酵培养基中， 30°C培养108h，得到黑曲霉C-2固态发酵曲，所述固态发酵曲通过低温干燥及粉碎后制得所述酶制剂，或通过O. 5mol/L pH=6. 5磷酸缓冲液中浸提获得所述酶制剂；其中，所述固态发酵培养基通过以下方法制备将麦麸95重量份、稻草秸杆粉90重量份、脐橙果洛或脐橙果皮粉90重量份、硫酸铵2重量份、硫酸镁O. 5重量份、磷酸氢二钾I 重量份加入水拌匀并调节水分湿度为60%，得所述固态发酵培养基。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，进一步包括将所述酶制剂经过超滤、浓缩制得浓缩酶制剂，或将所述酶制剂制备成粉剂或颗粒剂。
9.一种用于降解脐橙囊衣微生物的培养基，其特征在于，所述培养基为以脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣为碳源。
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，包括如下含量的组分=(NH4)2SO42g/ L 2. 5g/L、MgSO4 O. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉 6g/L 10g/L和琼脂15g/L 20g/L，并且在121°C温度下灭菌30min制得所述培养基。
11.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，包括如下含量的组分=(NH4)2SO42g/ L 2. 5g/L、MgS04 O. 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C温度下灭菌30min制得所述培养基。
全文摘要
本发明公开了一种用于降解脐橙囊衣微生物的培养基及酶制剂的制备方法。其中，该制备方法包括采用保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2012160的黑曲霉C-2(Aspergillus sp.C-2)作为发酵菌株，经过液体深层发酵或固态发酵培养制备得到降解脐橙囊衣酶制剂。采用本发明的技术方案，以脐橙囊衣粉或脐橙皮果渣为碳源的培养基对本发明中的微生物进行培养制备酶制剂，制得的酶制剂不仅降解脐橙囊衣效果明显，还利用脐橙果渣发酵产酶，变废为宝，既提高了脐橙产业的附加值，有保护了环境，具有经济和社会双重意义。
文档编号A23N15/06GK102994461SQ201210559099
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者赵良忠, 尹乐斌, 李文, 伍桃英, 肖凯, 郭育齐, 周小虎, 蒋琼华, 周晓洁 申请人:湖南李文食品有限公司