细胞冻存液及细胞冻存方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞冻存液及细胞冻存方法。该细胞冻存液按体积百分数包括90~95%的全细胞培养液及5~10%二甲基亚砜，其中，所述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清。这种细胞冻存液中的全细胞培养液为细胞生命代谢提供必须的营养物质，二甲基亚砜作为防冻剂，通过合理配比全细胞培养液中细胞培养基与胎牛血清的量及全细胞培养液与防冻剂的量，使得胎牛血清含量较低的全细胞培养液能够为细胞生命代谢提供必须的、足够的营养物质，而合适的防冻剂的量能够防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用，提高细胞的存活率，且该细胞冻存液不含易造成污染的血清，污染风险较低。
【专利说明】细胞冻存液及细胞冻存方法【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞冻存技术，特别是涉及一种细胞冻存液及细胞冻存方法。
【背景技术】
[0002]细胞冻存及复苏是细胞培养技术中的重要技术之一，细胞冻存是保存培养细胞的一种方法。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，这样可以最大限度的保存细胞活力。
[0003]细胞冻存液是细胞冻存时必须使用的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮于冻存液，供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。为了为细胞提供足够的营养，保持细胞的存活率，现有的细胞冻存液一般加入较多的血清作为细胞生长的营养物质，血清占细胞冻存液的体积一般从20%~90%不等，不仅价格昂贵，还易导致污染风险较高。
【发明内容】
[0004]基于此，有必要提供一种提高细胞存活率，且污染风险较低的细胞冻存液。
[0005]进一步，提供一种细胞冻存方法。
[0006]一种细胞冻存液，按体积百分数包括以下组分:
[0007]全细胞培养液 90~95% ；
[0008]二甲基亚砜5~10%;
[0009]其中，所述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清。
[0010]在其中一个实施例中，按体积百分数包括以下组分:
[0011]全细胞培养液 90%;
[0012]二甲基亚砜10%;
[0013]其中，所述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清。
[0014]在其中一个实施例中，所述细胞培养基包括下述组分:
[0015]无水氯化钙265.00mg/L ；硝酸铁0.10mg/L ;氯化钾400.00mg/L ；无水硫酸镁97.67mg/L ;氯化钠 6400.00mg/L ;无水磷酸二氢钠 109.00mg/L ;丁二酸 75.00mg/L ;丁二酸钠 100.00mg/L ；L-盐酸精氨酸 84.00mg/L ；L-盐酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-盐酸组氨酸42.00mg/L ;L_异亮氨酸105.00mg/L ;L_亮氨酸105.00mg/L ;L_盐酸赖氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-丝氨酸 42.00mg/L ；L-苏氨酸 95.00mg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟颜氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸钙4.0Omg/L ;酒石酸胆碱7.20mg/L ;叶酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;烟酰胺4.0Omg/L ;核黄素0.40mg/L ;盐酸硫胺4.00mg/L ;盐酸吡卩多辛4.00mg/L ;葡萄糖1000.00mg/L ;丙酮酸钠110.00mg/L 及酚红 9.30mg/L。
[0016]在其中一个实施例中，所述细胞培养基包括下述组分:
[0017]氯化钙116.6mg/L ;硫酸铜0.0013mg/L ;九水合硝酸铁0.05mg/L ;七水合硫酸亚铁0.417mg/L ;氯化钾311.8mg/L ;氯化镁28.64mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6999.6mg/L ;无水磷酸二氢钠54.35mg/L ;无水磷酸氢二钠71.02mg/L ;七水合硫酸锌0.432mg/L ；L-盐酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-盐酸组氨酸31.48mg/L ；L-异亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-盐酸赖氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-丝氨酸26.25mg/L ；L-苏氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-门冬酰胺 7.5mg/L ；L-门冬氨酸6.65mg/L ;L-盐酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-缴氨酸52.85mg/L ;无水葡萄糖3151mg/L ;次黄嘌呤2mg/L ;亚油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚红 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二盐酸盐 0.08Img/L ;丙酮酸钠55mg/L ;维生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韩2.24mg/L ;氯化胆碱8.98mg/L ;叶酸
2.65mg/L ;肌醇12.6mgL ;烟酰胺2.02mg/L ;盐酸批卩多醒2mg/L ;盐酸批卩多醇0.03mgL ;核黄素 0.219mg/L ;盐酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及维生素 B120.68mg/L。
[0018]在其中一个实施例中，所述细胞培养基包括下述组分:
[0019]四水硝酸|丐100mg/L ;氯化钾400mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6000mg/L ；无水磷酸氢二钠800mg/L ；L-盐酸精氨酸200mg/L ；L-门冬酰胺50mg/L ；L-门冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-盐酸组氨酸15mg/L ；L-轻脯氨酸20mg/L ；L-异亮氨酸50mg/L ；L-盐酸赖氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-丝氨酸30mg/L ；L-苏氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-缴氨酸20mg/L ;无水葡萄糖2000mg/mL ;还原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹红5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韩0.25mg/L ;氯化胆碱3mg/L ;叶酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;烟酰胺lmg/L ;对氨基苯甲酸lmg/L ;维生素B6lmg/L ;维生素B20.2mg/L ;维生素 B1 lmg/L 及维生素 B120.005mg/L。
[0020]一种细胞冻存方 法，包括如下步骤:
[0021]将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，并将所述洗涤后的对数期的细胞用上述细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用所述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为0.5飞X IO6个/毫升的对数期的细胞与所述细胞冻存液的混合液；
[0022]将所述浓度为0.5飞X IO6个/毫升的对数期的细胞与所述细胞冻存液的混合液分装于ImL的无菌冻存管中；
[0023]将所述装有浓度为0.5飞X IO6个/毫升的对数期的细胞与所述细胞冻存液的混合液的无菌冻存管放置于程序降温盒中降温至_80°C，并于_80°C下放置24小时~96小时，然后将所述无菌冻存管转移至液氮中保存。
[0024]在其中一个实施例中，所述细胞为贴壁细胞，所述将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤的步骤为:将所述贴壁细胞培养至对数期后，除去培养皿中的细胞培养液，加入PBS缓冲液进行洗涤，然后除去所述PBS缓冲液。
[0025]在其中一个实施例中，将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤的步骤之后还包括细胞消化的步骤，所述细胞消化的步骤为:向所述贴壁细胞的表面加入0.5^2mL浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培养箱内消化2飞分钟，再加入3~5mL所述细胞冻存液的全细胞培养液，以终止所述胰蛋白酶的消化作用，然后将所述贴壁细胞吹散，并将所述贴壁细胞与所述全细胞培养液的混合液于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到细胞沉淀。[0026]在其中一个实施例中，所述胰蛋白酶溶液中含有浓度为0.38%的乙二胺四乙酸。
[0027]在其中一个实施例中，所述细胞为悬浮细胞，所述将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤的步骤具体为:将所述悬浮细胞培养至对数期后，将含有对数期的细胞的细胞培养液于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到细胞沉淀，加入PBS缓冲液，再于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到洗涤后的细胞沉淀。
[0028]上述细胞冻存液中的全细胞培养液为细胞生命代谢提供必须的营养物质，二甲基亚砜作为防冻剂，通过合理配比全细胞培养液中细胞培养基与胎牛血清的量及全细胞培养液与防冻剂的量，使得胎牛血清含量较低的全细胞培养液能够为细胞生命代谢提供必须的、足够的营养物质，而合适的防冻剂的量能够防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用，提高细胞的存活率，且该细胞冻存液不含易造成污染的血清，污染风险较低。
【专利附图】
【附图说明】[0029]图1为一实施方式的细胞冻存方法流程图。
【具体实施方式】
[0030]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0031]一实施方式的细胞冻存液，按体积百分数包括以下组分:全细胞培养液90、5%及二甲基亚砜5~10%。
[0032]全细胞培养液包括细胞培养基和胎牛血清，细胞培养基和胎牛血清的体积比为9:1。
[0033]全细胞培养液为细胞生命代谢提供必须的营养物质。二甲基亚砜作为防冻剂，能提高细胞膜对水的通透性，利于细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶造成的细胞损伤。
[0034]上述细胞冻存液通过合理配比营养物质全细胞培养液中的细胞培养液与胎牛血清的量及全细胞培养液及防冻剂二甲基亚砜的量，能够为细胞提供必须的营养物质并能够减少由于冰晶造成的细胞损伤，从而能够提高细胞的存活率。并且，由于该营养物质不含有昂贵的血清，污染风险较低，同时成本较低，有利于降低冻存成本。
[0035]优选地，全细胞培养液的体积百分数为90%，二甲基亚砜的体积百分数为10%。
[0036]优选地，细胞培养基包括以下组分:
[0037]氯化钙116.6mg/L ;硫酸铜0.0013mg/L ;九水合硝酸铁0.05mg/L ;七水合硫酸亚铁0.417mg/L ;氯化钾311.8mg/L ;氯化镁28.64mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6999.6mg/L ;无水磷酸二氢钠54.35mg/L ;无水磷酸氢二钠71.02mg/L ;七水合硫酸锌
0.432mg/L ；L-盐酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-盐酸组氨酸31.48mg/L ；L-异亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-盐酸赖氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-丝氨酸26.25mg/L ；L-苏氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-门冬酰胺 7.5mg/L ；L-门冬氨酸
6.65mg/L ;L-盐酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-缴氨酸52.85mg/L ;无水葡萄糖3151mg/L ;次黄嘌呤2mg/L ;亚油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚红 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二盐酸盐 0.08Img/L ;丙酮酸钠55mg/L ;维生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韩2.24mg/L ;氯化胆碱8.98mg/L ;叶酸
2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;烟酰胺2.02mg/L ;盐酸批卩多醒2mg/L ;盐酸批卩多醇0.03mgL ;核黄素 0.219mg/L ;盐酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及维生素 B120.68mg/L。
[0038]在其他实施方式中，细胞培养基包括以下组分:氯化钙116.6mg/L;硫酸铜0.0013mg/L ;九水合硝酸铁0.05mg/L ;七水合硫酸亚铁0.417mg/L ;氯化钾311.8mg/L ;氯化镁28.64mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6999.6mg/L ;无水磷酸二氢钠54.35mg/L ;无水磷酸氢二钠71.02mg/L ;七水合硫酸锌0.432mg/L ；L-盐酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ;甘氨酸18.75mg/L ；L-盐酸组氨酸31.48mg/L ；L-异亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-盐酸赖氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸 35.48mg/L ；L-丝氨酸 26.25mg/L ；L-苏氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸4.45mg/L ；L-门冬酰胺7.5mg/L ；L-门冬氨酸6.65mg/L ；L-盐酸半胱氨酸17.56mg/L ；L-谷氨酸 7.35mg/L ；L-脯氨酸 17.25mg/L ；L-色氨酸 9.02mg/L ；L-酪氨酸 mg/L ；L-缴氨酸52.85mg/L ;无水葡萄糖3151mg/L ;次黄嘌呤2mg/L ;亚油酸0.042mg/L ;硫辛酸0.105mg/L ;酚红 8.lmg/L ；1, 4-丁二胺二盐酸盐 0.08lmg/L ;丙酮酸钠 55mg/L ;维生素 H0.0035mg/L ；D-泛酸钙 2.24mg/L ;氯化胆碱 8.98mg/L ;叶酸 2.65mg/L ;肌醇 12.6mg/L ;烟酰胺 2.02mg/L ;盐酸吡B多醒2mg/L ;盐酸吡B多醇0.03mg/L ;核黄素0.219mg/L ;盐酸硫胺2.17mg/L ;胸苷0.365mg/L 及维生素 B120.68mg/L。
[0039]在另外的实施方 式中，细胞培养基包括以下组分:
[0040]四水硝酸钙100mg/L ;氯化钾400mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6000mg/L ；无水磷酸氢二钠800mg/L ；L-盐酸精氨酸200mg/L ；L-门冬酰胺50mg/L ；L-门冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-盐酸组氨酸15mg/L ；L-轻脯氨酸20mg/L ；L-异亮氨酸50mg/L ；L-盐酸赖氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-丝氨酸30mg/L ；L-苏氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-缴氨酸20mg/L ;无水葡萄糖2000mg/mL ;还原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹红5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韩0.25mg/L ;氯化胆碱3mg/L ;叶酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;烟酰胺lmg/L ;对氨基苯甲酸lmg/L ;维生素B6lmg/L ;维生素B20.2mg/L ;维生素 B1 lmg/L 及维生素 B120.005mg/L。
[0041]上述细胞冻存液的全细胞培养液中的细胞培养基分别采用上述三种不同的配方时，上述细胞冻存液能够适用于293细胞、Hela细胞、MCF-7细胞、CHO细胞、Raji细胞、Daudi细胞、HL60细胞、K562细胞等多种细胞，适用性广泛。
[0042]请参阅图1，一种细胞冻存方法，包括如下步骤:
[0043]步骤SllO:将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，并将洗涤后的对数期的细胞用上述细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用上述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为0.5飞X IO6个/毫升的对数期的细胞与细胞冻存液的混合液。
[0044]欲冻存的细胞应为生长良好的状态，因此取对数期的细胞冻存。在细胞冻存前，先用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)对细胞进行清洗，以除去细胞培养基。
[0045]当欲冻存的细胞为悬浮细胞时，将悬浮细胞培养至对数期后，将含有对数期的细胞的细胞培养液于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到细胞沉淀，然后加入PBS缓冲液重悬细胞，再于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到洗涤后的细胞沉淀。将洗涤后的细胞沉淀用上述细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用上述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为0.5飞X IO6个/毫升的对数期的细胞与细胞冻存液的混合液。
[0046]当欲冻存的细胞为贴壁细胞时，将该贴壁细胞培养至对数期后，用移液枪或移液管吸掉培养皿中的细胞培养液，向培养皿中加入PBS缓冲液，轻轻晃动进行洗涤，然后用移液枪或移液管除去PBS缓冲液。
[0047]洗涤后，贴壁细胞仍然贴附于培养皿上，需要进行细胞消化，以使培养皿上的贴壁细胞分散。细胞消化的步骤具体为:向贴壁细胞的表面加入0.5^2mL浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培养箱内消化2飞分钟，再加入3~5mL上述细胞冻存液的全细胞培养液，以终止胰蛋白酶的消化作用，然后将贴壁细胞吹散，并将贴壁细胞与全细胞培养液的混合液于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到细胞沉淀。将该细胞沉淀用上述细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用上述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为0.5飞X IO6个/毫升的对数期的细胞与细胞冻存液的混合液。
[0048]浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液为将一定量的胰蛋白酶溶解于PBS缓冲液中，其中，胰蛋白酶的质量与PBS缓冲液的体积的比值为0.25g: 100mL。
[0049]消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰蛋白酶流失；消化不足则细胞难于从培养皿上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。因此消化的时间优选为2~5分钟。消化时间为至显微镜下观察细胞变圆即可。
[0050]优选地，当贴壁细胞在培养皿上贴壁太紧时，为了便于将贴壁细胞分散，胰蛋白酶溶液中含有浓度为0.38%的乙二胺四乙酸(EDTA)。乙二胺四乙酸的质量与胰蛋白酶溶液中的PBS缓冲液的体积之比为0.038g: 100mL。
[0051]细胞浓度过密或过稀都会降低细胞的存活率，用上述细胞冻存液进行稀释，使细胞的浓度0.5-5X 1O6个/毫升，以保证细胞的存活率。
[0052]步骤S120:将浓度为0.5-5X 1O6个/毫升的对数期的细胞与细胞冻存液的混合液分装于ImL的无菌冻存管中。
[0053]将浓度为0.5-5X 1O6个/毫升的对数期的细胞与细胞冻存液的混合液分装入多个ImL的无菌冻存管中分别进行冻存，当需要进行复苏使用时，根据需要取出一个或多个冻存了细胞的无菌冻存管，不会造成对其他冻存了细胞的无菌冻存管的污染。
[0054]步骤S130:将装有浓度为0.5-5X 1O6个/毫升的对数期的细胞与上述细胞冻存液的混合液的多个无菌冻存管放置于程序降温盒中降温至_80°C，并于_80°C下放置24小时~96小时，然后将多个无菌冻存管转移至液氮中保存。
[0055]装有浓度为0.5-5X 1O6个/毫升的对数期的细胞与上述细胞冻存液的混合液的无菌冻存管放置于程序降温盒中匀速降温，有利于提高细胞的存活率。
[0056]装有浓度为0.5-5X 1O6个/毫升的对数期的细胞与上述细胞冻存液的混合液的无菌冻存管于程序降温盒中降温至-80°C后，于-80°C下放置24小时~96小时，然后转移至液氣中保存。
[0057]在进行细胞复苏时，首先从液氮中取出所需的数量的无菌冻存管，将无菌冻存管立即放入37°C水浴中，摇动使冻存细胞在f 2分钟内融化；然后于500-1000转/分钟下离心3~10分钟，弃上清；加入1ml上述全细胞培养液重悬细胞，将该细胞与全细胞培养液的悬浮液加入8~12ml上述全细胞培养液中，于37°C下静置培养16~24小时。
[0058]培养16~24小时后，于显微镜下观察细胞复苏后的状态，更换全细胞培养液，继续培养，2~3天后传代培养。
[0059]当细胞为贴壁细胞时，于显微镜下观察，80%以上的细胞贴壁生长后再更换全细胞
培养液。
[0060]上述细胞冻存方法使用包括体积分数为90-95%全细胞培养液和体积分数为5~10%的二甲基亚枫的细胞冻存液进行冻存细胞，有利于提高细胞的存活率，并降低污染风险。
[0061]并且全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清，胎牛血清在细胞冻存液中的体积分数仅为扩9.5%，含量较低，使用血清含量较低的细胞冻存液，冻存成本低。
[0062]以下为具体实施例。
[0063]实施例1
[0064]1、将293细胞培养至对数期后，在无菌环境下，用电动移液管吸掉培养皿中的细胞培养液中，向培养皿中加入IOmL PBS缓冲液，轻轻晃动进行洗涤，然后用电动移液管除去PBS缓冲液；
[0065]2、在无菌环境下，向培养皿中的293细胞的表面均匀加入0.5mL浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培养箱内消化2分钟，向培养皿内加入3mL全细胞培养液，终止胰蛋白酶的消化作用，然后用电动移液管将293细胞从培养皿上吹散下来使293细胞悬浮于上述全细胞培养液中；其中，上述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清，细胞培养基包括下述组分:
[0066]无水氯化钙265.00mg/L ；硝酸铁0.10mg/L ;氯化钾400.0Omg/L ；无水硫酸镁97.67mg/L ;氯化钠 6400.0Omg/L ;无水磷酸二氢钠 109.0Omg/L ;丁二酸 75.0Omg/L ;丁二酸钠 100.00mg/L ；L-盐酸精氨酸 84.00mg/L ；L-盐酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-盐酸组氨酸42.00mg/L ；L-异亮氨酸105.00mg/L ；L-亮氨酸105.00mg/L ；L-盐酸赖氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-丝氨酸 42.0Omg/L ；L-苏氨酸 95.0Omg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟颜氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸钙4.0Omg/L ;酒石酸胆碱7.20mg/L ;叶酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;烟酰胺4.0Omg/L ;核黄素0.40mg/L ;盐酸硫胺4.0Omg/L ;盐酸吡卩多辛4.0Omg/L ;葡萄糖1000.0Omg/L ;丙酮酸钠110.0Omg/L 及酚红 9.30mg/L ；
[0067]3、将293细胞与全细胞培养液的悬浮液转移至15ml无菌离心管中，于500转/分钟下离心10分钟，弃去上清液得到293细胞沉淀，将该293细胞沉淀用细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用上述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为0.5 X IO6个/毫升的对数期的293细胞与细胞冻存液的混合液；其中，上述细胞冻存液按体积百分数包括90%的上述全细胞培养液及10%的二甲基亚砜；[0068]4、将浓度为0.5 X IO6个/毫升的对数期的293细胞与细胞冻存液的混合液分装于ImL的无菌冻存管中；
[0069]5、将装有浓度为0.5X IO6个/毫升的对数期的293细胞与上述细胞冻存液的混合液的多个无菌冻存管放置于程序降温盒(Nalgene，货号:5100_0001C)中，于_80°C下放置24小时，然后将多个无菌冻存管转移至液氮中保存。
[0070]冻存一个月后，进行细胞复苏，首先从液氮中取出I支无菌冻存管，将该无菌冻存管立即放入37°C水浴中，摇动使冻存细胞在I分钟内融化；然后于500转/分钟下离心10分钟，弃上清；加入1ml上述全细胞培养液重悬细胞，将该细胞与全细胞培养液的悬浮液加入8ml上述全细胞培养液中，于37°C下静置培养24小时，测定细胞的存活率，存活率为90%。
[0071]实施例2
[0072]1、将MCF-7细胞培养至对数期后，在无菌环境下，用电动移液管吸掉培养皿中的细胞培养液中，向培养皿中加入15mL PBS缓冲液，轻轻晃动进行洗涤，然后用电动移液管除去PBS缓冲液；
[0073]2、在无菌环境下，向培养皿中的MCF-7细胞的表面均匀加入2mL浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培养箱内消化5分钟，向培养皿内加入5mL全细胞培养液，终止胰蛋白酶的消化作用，然后用电动移液管将MCF-7细胞从培养皿上吹散下来使MCF-7细胞悬浮于上述全细胞培养液中；其中，上述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清，细胞培养基包括下述组分:
[0074]氯化钙116.6mg/L ;硫酸 铜0.0013mg/L ;九水合硝酸铁0.05mg/L ;七水合硫酸亚铁0.417mg/L ;氯化钾311.8mg/L ;氯化镁28.64mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6999.6mg/L ;无水磷酸二氢钠54.35mg/L ;无水磷酸氢二钠71.02mg/L ;七水合硫酸锌0.432mg/L ；L-盐酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-盐酸组氨酸31.48mg/L ；L-异亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-盐酸赖氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-丝氨酸26.25mg/L ；L-苏氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-门冬酰胺 7.5mg/L ；L-门冬氨酸6.65mg/L ；L-盐酸半胱氨酸 17.56mg/L ；L-谷氨酸 7.35mg/L ；L-脯氨酸 17.25mg/L ；L-色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-缴氨酸52.85mg/L ;无水葡萄糖3151mg/L ;次黄嘌呤2mg/L ;亚油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚红 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二盐酸盐 0.08Img/L ;丙酮酸钠55mg/L ;维生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韩2.24mg/L ;氯化胆碱8.98mg/L ;叶酸2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;烟酰胺2.02mg/L ;盐酸批卩多醒2mg/L ;盐酸批卩多醇0.03mgL ;核黄素 0.219mg/L ;盐酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及维生素 B120.68mg/L ；
[0075]3、将MCF-7细胞与全细胞培养液的悬浮液转移至15ml无菌离心管中，于1000转/分钟下离心3分钟，弃去上清液得到MCF-7细胞沉淀，将该MCF-7细胞沉淀用细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用上述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为5 X IO6个/毫升的对数期的MCF-7细胞与细胞冻存液的混合液；其中，上述细胞冻存液按体积百分数包括95%的上述全细胞培养液及5%的二甲基亚砜；
[0076]4、将浓度为5 X IO6个/毫升的对数期的MCF-7细胞与细胞冻存液的混合液分装于ImL的无菌冻存管中；[0077]5、将装有浓度为5X IO6个/毫升的对数期的MCF-7细胞与上述细胞冻存液的混合液的多个无菌冻存管放置于程序降温盒(Nalgene，货号:5100_0001C)中，于_80°C下放置96小时，然后将多个无菌冻存管转移至液氮中保存。
[0078]冻存3个月后，进行细胞复苏，首先从液氮中取出I支无菌冻存管，将该无菌冻存管立即放入37°C水浴中，摇动使冻存细胞在1.5分钟内融化；然后于1000转/分钟下离心3分钟，弃上清；加入1ml上述全细胞培养液重悬细胞，将该细胞与全细胞培养液的悬浮液加入12ml上述全细胞培养液中，于37°C下静置培养16小时，测定细胞的存活率，存活率为85%。
[0079]实施例3
[0080]1、将HL60细胞培养至对数期后，将含有对数期的细胞的细胞培养液于800转/分钟下离心6min，弃去上清得到HL60细胞沉淀，然后加入12mL PBS缓冲液重悬细胞，再于800转/分钟下离心6min,弃去上清得到洗漆后的HL60细胞沉淀；
[0081]2、将洗涤后的HL60细胞沉淀用细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用上述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为2X1O6个/毫升的对数期的HL60细胞与细胞冻存液的混合液；其中，上述细胞冻存液按体积百分数包括90%的全细胞培养液及10%的二甲基亚砜，该全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清，细胞培养基包括下述组分:
[0082]四水硝酸钙100mg/L ;氯化钾400mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6000mg/L ；无水磷酸氢二钠800mg/L ；L-盐酸精氨酸200mg/L ；L-门冬酰胺50mg/L ；L-门冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-盐酸组氨酸15mg/L ；L-轻脯氨酸20mg/L ；L-异亮氨酸50mg/L ；L-盐酸赖氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-丝氨酸30mg/L ；L-苏氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-缴氨酸20mg/L ;无水葡萄糖2000mg/mL ;还原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹红5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韩0.25mg/L ;氯化胆碱3mg/L ;叶酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;烟酰胺lmg/L ;对氨基苯甲酸lmg/L ;维生素B6lmg/L ;维生素B20.2mg/L ;维生素 B1 lmg/L 及维生素 B120.005mgL ；
[0083]3、将浓度为2 X IO6个/毫升的对数期的HL60细胞与细胞冻存液的混合液分装于ImL的无菌冻存管中；
[0084]4、将装有浓度为2 X IO6个/毫升的对数期的HL60细胞与上述细胞冻存液的混合液的多个无菌冻存管放置于程序降温盒(Nalgene，货号:5100_0001C)中，于_80°C下放置48小时，然后将多个无菌冻存管转移至液氮中保存。
[0085]冻存6个月后，进行细胞复苏，首先从液氮中取出I支无菌冻存管，将该无菌冻存管立即放入37°C水浴中，摇动使冻存细胞在2分钟内融化；然后于800转/分钟下离心5分钟，弃上清；加入1ml上述全细胞培养液重悬细胞，将该细胞与全细胞培养液的悬浮液加入IOml上述全细胞培养液中，于37°C下静置培养20小时，测定细胞的存活率，存活率为88%。
[0086]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种细胞冻存液，其特征在于，按体积百分数包括以下组分: 全细胞培养液 90~95% ； 二甲基亚砜5~10%; 其中，所述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，按体积百分数包括以下组分: 全细胞培养液 90% ； 甲基亚讽10% ； 其中，所述全细胞培养液包括体积比为9:1的细胞培养基和胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞培养基包括下述组分: 无水氯化钙265.00mg/L ;硝酸铁0.10mg/L ;氯化钾400.00mg/L ;无水硫酸镁97.67mg/L ;氯化钠 6400.00mg/L ;无水磷酸二氢钠 109.00mg/L ; 丁二酸 75.00mg/L ; 丁二酸钠100.00mg/L ;L-盐酸精氨酸 84.00mg/L ;L_ 盐酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-盐酸组氨酸42.00mg/L ;L_异亮氨酸105.00mg/L ;L_亮氨酸105.00mg/L ;L_盐酸赖氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-丝氨酸 42.00mg/L ；L-苏氨酸 95.00mg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟颜氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸钙4.0Omg/L ;酒石酸胆碱7.20mg/L ;叶酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;烟酰胺4.0Omg/L ;核黄素0.40mg/L ;盐酸硫胺4.00mg/L ;盐酸吡卩多辛4.00mg/L ;葡萄糖1000.00mg/L ;丙酮酸钠110.00mg/L 及酚红 9.30mg/L。
4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞培养基包括下述组分: 氯化钙116.6mg/L ；硫酸铜0.0013mg/L ;九水合硝酸铁0.05mg/L ;七水合硫酸亚铁0.417mg/L ;氯化钾311.8mg/L ;氯化镁28.64mg/L ；无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6999.6mg/L ;无水磷酸二氢钠54.35mg/L ;无水磷酸氢二钠71.02mg/L ;七水合硫酸锌0.432mg/L ；L-盐酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-盐酸组氨酸31.48mg/L ；L-异亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-盐酸赖氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-丝氨酸26.25mg/L ；L-苏氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-门冬酰胺 7.5mg/L ；L-门冬氨酸6.65mg/L ;L-盐酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-缴氨酸52.85mg/L ;无水葡萄糖3151mg/L ;次黄嘌呤2mg/L ;亚油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚红 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二盐酸盐 0.08Img/L ;丙酮酸钠55mg/L ;维生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韩2.24mg/L ;氯化胆碱8.98mg/L ;叶酸2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;烟酰胺2.02mg/L ;盐酸批卩多醒2mg/L ;盐酸批卩多醇0.03mgL ;核黄素 0.219mg/L ;盐酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及维生素 B120.68mg/L。
5.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞培养基包括下述组分: 四水硝酸1丐100mg/L ;氯化钾400mg/L ;无水硫酸镁48.84mg/L ;氯化钠6000mg/L ;无水磷酸氢二钠800mg/L ；L-盐酸精氨酸200mg/L ；L-门冬酰胺50mg/L ；L-门冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸盐酸盐65.15mg/L ;L_谷氨酸20mg/L ;L_谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ;L-盐酸组氨酸15mg/L ；L-羟脯氨酸20mg/L ；L-异亮氨酸50mg/L ；L-盐酸赖氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-丝氨酸30mg/L ；L-苏氨酸20mg/L ;L-色氨酸5mg/L ;L-酪氨酸20mg/L ;L-缴氨酸20mg/L ;无水葡萄糖2000mg/mL ;还原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹红5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸钙0.25mg/L ;氯化胆碱3mg/L ;叶酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;烟酰胺lmg/L ;对氨基苯甲酸lmg/L ;维生素B6lmg/L ;维生素B20.2mg/L ;维生素BJmg/L及维生素B120.005mg/L。
6.一种细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤: 将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，并将所述洗涤后的对数期的细胞用如权利要求f 5任一项所述的细胞冻存液进行悬浮，然后进行细胞计数，并用所述细胞冻存液进行稀释，得到浓度为0.5-5×1O6个/毫升的对数期的细胞与所述细胞冻存液的混合液； 将所述浓度为0.5-5× 1O6个/毫升的对数期的细胞与所述细胞冻存液的混合液分装于ImL的无菌冻存管中； 将所述装有浓度为0.5-5× 1O6个/毫升的对数期的细胞与所述细胞冻存液的混合液的无菌冻存管放置于程序降温盒中降温至_80°C，并于_80°C下放置24小时~96小时，然后将所述无菌冻存管转移至液氮中保存。
7.根据权利要求6所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞为贴壁细胞，所述将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤的步骤为:将所述贴壁细胞培养至对数期后，除去培养皿中的细胞培养液，加入PBS缓冲液进行洗涤，然后除去所述PBS缓冲液。
8.根据权利要求7所述的细胞冻存方法，其特征在于，将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤的步骤之后还包括细胞消化的步骤，所述细胞消化的步骤为:向所述贴壁细胞的表面加入0.5^2mL浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培养箱内消化2-5分钟，再加入3-5mL所述细胞冻存液的全细胞培养液，以终止所述胰蛋白酶的消化作用，然后将所述贴壁细胞吹散，并将所述贴壁细胞与所述全细胞培养液的混合液于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟,弃去上清得到细胞沉淀。
9.根据权利要求8所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液中含有浓度为0.38%的乙二胺四乙酸。
10.根据权利要求6所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞为悬浮细胞，所述将对数期的细胞用PBS缓冲液进行洗涤的步骤具体为:将所述悬浮细胞培养至对数期后，将含有对数期的细胞的细胞培养液于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到细胞沉淀，加入PBS缓冲液，再于500转/分钟~1000转/分钟下离心3分钟~10分钟，弃去上清得到洗涤后的细胞沉淀。
【文档编号】A01N1/02GK103891709SQ201210568487
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】万晓春, 陈凤莲, 赵琦, 李红昌 申请人:深圳先进技术研究院