专利名称：链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物农药技术领域，具体是指一种链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用。
背景技术：
十字花科根肿病(plasmodiophoa brassicae Woron)是一种世界性土传病害，致病菌为芸苔根肿菌，属于一种专性寄生低等鞭毛菌(也有学者将其归入粘菌)，目前尚无法人工培养。主要危害十字花科蔬菜如:大白菜、甘蓝、萝卜等。其病菌以孢子囊在土壤或未腐熟的厩肥中越冬越夏，对不良环境抵抗力强，一般能存活十年以上。田间最初侵染源来自土壤和未腐熟的厩肥带菌。病菌又可随菜苗、泥土携带传播到无病区。病菌从菜苗的幼根或根毛侵入，并刺激根部细胞加速分裂，造成根部畸形肿大，导致植株输导组织受阻，地上部生长缓慢，叶片萎蔫，重者根部腐烂，植株死亡。近年，根肿病在湖北、云南、四川、贵州、浙江、福建等地高山十字花科蔬菜种植区发生严重，已成为制约我国高山大白菜、甘蓝、萝卜反季节生产的主要因素之一，其中尤以大白菜、甘蓝受害最重，严重地块甚至绝收，每亩损失3000元以上。目前，防治十字花科根肿病常用方法主要包括撒石灰调节土壤pH、轮作、种植抗病品种等，但由于存在土壤板结、经济效益差、不耐储运等缺点，上述措施均未大面积推广。常规杀菌剂有多菌灵、福美双、代森锰锌等，但防效均不明显，防效表现较好的是日本石原株式会社的50%氟啶胺SC与10%氰霜唑SC组合，但由于抑制种子萌发及使用成本高昂(每亩近400元)等原因，也尚未得到大面积推广应用。关于十字花科根肿病生物农药在真菌、放线菌、芽孢杆菌等方面均有一定的研究报道，并且取得了一定的成绩，如日本研究者将大白菜播种在从麦田、油菜田、白菜地及草地采回的土壤中，从大白菜根中分离得到大量内生真菌，通过盆栽试验筛选获得2株内生真菌(Heteroconium chaetospira)H4007,M4006,病指分别为23，15， 显著高于其他属种处理及空白对照，通过种子处理显示有促生作用；有研究者利用(Phoma glomerata) JCM 9972有效控制根肿病的发生；也有国外研究者通过温室和田间试验得到可抑制根肿病菌的3个木霉菌株(TC32，TC45和TC63)和I个链霉菌菌株(S99);韩国研究人员从大白菜根部分离获得81株内生放线菌，通过大白菜根肿病盆栽试验，获得3株具有开发潜力的内生放线菌,其中2株(Microbispora rosea)和(subsp.rosea)防效分别为 58% 和 33%, I 株(Streptomyces olivochromogenes)防效达 42% ;我国四川农大研究人员从四川根际土中分离出I株灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber),其对大白菜根肿病盆栽实验防效达到73.69%;何月秋等研究人员从大白菜根际土壤中分离到I株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-l，其对根肿病的室内防效达85%，田间防效达68.6^84.8% ;长江大学将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)与固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)用于根肿病综合防治，防效达到85%。链霉菌具有抗生作用，还具有可田间定殖等作为生物农药予以开发的优点。美国环境保护署美国环保局2012年公布了 I项疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)RL-1lO用于除草的生物农药研究计划。全球已登记在册的链霉菌农药共有6种，登记国家和地区分别为韩国、欧盟、乌克兰、加拿大、美国，具体为(Streptomyces colombiensis)(韩国)、(Streptomyces kasugaensis)(韩国)、(Streptomyces griseoviridis)K61 (欧盟、力口拿大、美国)、(Streptomyces albus)(乌克兰)、(Streptomyces avermitilis)(乌克兰)、(Streptomyces lydicus) WYEC 108 (加拿大、美国)，防治对象主要为真菌病害包括叶部病害与土传性病害(其中S.avermitilis用于防治甲虫与叶螨)。但截至目前，尚无防治十字花科根肿病的链霉菌农药登记。
发明内容
本发明的目的之一是要提供一种具有防治十字花科根肿病用途的链霉菌，该链霉菌包括疮痂链霉菌(Sti ^ptomyces scabiei ) WS-24926 CCTCC NO:M 2012393 和 / 或尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS_29246 CCTCC NO:M 2012413。本发明所提供的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS_24926已于2012年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC);保藏登记号为CCTCC M 2012393 ;保藏地点为:中国、武汉、武汉大学。尖抱链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS_29246 已于 2012 年 10 月 18 日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC);保藏登记号为CCTCC M 2012413，保藏地点为:中国、武汉、武汉大学。所述疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) WS-24926是从湖南浏阳远郊植物根际土壤中分离得到的。综合疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS_24926的形态学特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析的结果，将其鉴定为疮痂链霉菌。具体鉴定结果如下:( I)菌体的形态特征疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) WS-24926菌株在ISP-2固体培养基上，菌落干燥、表面不光滑，有突起，浅灰色；孢子多，链状，短棍状，大小(长1.5 μ m-2 μ m，宽
0.6 μ m-0.8 μ m)，灰色，气丝乳白色或灰色，有螺旋孢子丝产生；色素不明显；在察氏固体培养基上无色素产生，气丝及孢子堆白色，基丝无色。在天门冬素固体培养基上培养基丝黄色，气丝及孢子堆灰白色，无色素产生。(2)生理生化特性不产生黑色素，能利用糊精、吐温40、L 一阿拉伯糖、D-木糖、琥珀酸单甲酯、丙酮酸、丙二醇、D-核糖、D-L-α -憐酸甘油。不能利用:吐温80、α _环糊精、糖原、甘露聚糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-纤维二糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露醇、a -D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、麦芽糖、乳果糖、D-甘露糖、L-丙氨酸、D-丙氨酸、琥珀酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-丙氨酸胺、L-谷氨酸、腺苷、肌苷、胸苷、L-鼠李糖、尿苷、蔗糖、水杨苷、6-磷酸-D-果糖、6-磷酸-D-葡萄糖。(3) 16SrDNA 序列分析疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS_24926菌株经PCR技术,DNA测序仪分析，该菌株的16SrDNA序列由1391个碱基组成。用BLAST程序对疮痂链霉菌(Sti^ptomycesscabiei) WS-24926的16SrDNA序列和GenBank中已登录的16SrDNA序列进行核昔酸同源性比较，结果与已报道的疮痂链霉菌(S.scabiei) ATCC 49173 (T)(登录号AB026199)的16SrDNA序列同源性达到100%，鉴定其为疮痂链霉菌。所述尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246是从安徽岳西远郊植物根际土壤中分离得到的。综合尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS_29246的形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析的结果，将其鉴定为尖孢链霉菌。具体鉴定结果如下:(I)菌体的形态特征尖抱链霉菌(Streptomycescuspidosporus)WS_29246 在 ISP-2 固体培养基上，菌落干燥、表面不光滑，有突起，有褶皱，乳白色或微黄色，有螺旋状孢子丝，2-5圈不等；基丝黄褐色，无分隔，不断裂，呈波浪型，多分枝，直径0.4 μ m-0.6 μ m。在察氏固体培养基上无色素产生，菌落表面光滑，不产孢。在PDA培养基上产生朽1檬黄色素。(2)生理生化特性不产生黑色素，利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、D-甘露醇以及D-半乳糖、乳糖、甘露糖、蜜二糖、海藻糖、D-麦芽糖、柠檬酸钠、琥珀酸钠。(3) 16SrDNA 序列分析尖抱链霉菌(Streptomycescuspidosporus) WS-29246 经 PCR 技术，DNA 测序仪分析，获得该菌株的16S rDNA序列，然后用BLAST程序对尖孢链霉菌(Str印tomycescuspidosporus)WS_29246的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)的16S rDNA序列同源性达到100%,鉴定其为尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)。所述疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) WS-24926和所述尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246采用液体发酵培养,其使用的培养基如下:(I)斜面培养基:培养基配方如下:称取麦芽提取物:1.(Γ2.0g/L，可溶性淀粉:0 5g/L，酵母提取物:0.4 1.0g/L,葡萄糖:0 2.0g/L,蔗糖:0 2.0g/L,琼脂:1.5 2.0g/L,pH 值 7.0 8.0,定容至 IOOOmL0(2)种子培养基:甘露醇:l(T20g/L，大豆蛋白胨:5 20g/L，鱼粉:(T5.0g/L，豆油:
0.5 5.0g/L, K2HPO4:0.15 0.5g/L, CaCO3:0.Γθ.4g/L, pH 值 7.0 8.0,定容至 IOOOmL0(3)发酵培养基:葡萄糖:2 8g/L，葡萄糖:2 8g/L，可溶性淀粉:5 10g/L，大豆粉:(Tl0g/L，棉子粉:0 25g/L，酵母提取物:1 3g/L，CaCO3:2 5g/L，NaCl:2 5g/L，pH 值
7.0 8.0，定容至 IOOOmL0培养流程:(I)将所述疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) WS-24926和所述尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246菌种分别接种试管斜面培养基上，在温度28 ± I °C条件下，活化培养5d;(2)将活化的菌种接种至种子培养基中，在温度28±1°C的摇床内培养3 4d ；(3)将步骤2)中培养的菌种接种到发酵培养基中，在温度28±1°C的条件下发酵培养3 4d。
本发明提供了所述链霉菌在防治十字花科根肿病中的应用。本发明还提供了所述链霉菌制备而成的防治十字花科根肿病的生防悬浮剂及其制备方法。所述生防悬浮剂按重量百分比由1(Γ80%的发酵菌液、0.4 10%的分散剂、0.5^5%的乳化剂、0.Γ10%的增稠剂、0.Γ10%的防腐剂、(Γ3.0%的消泡剂、(Γ10.0%的防冻剂和余量的水组成，其中，所述发酵菌液是由所述链霉菌发酵得到的菌液。进一步地，所述分散剂选用木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、萘磺酸钠甲醛缩合物、脂肪酰胺-N-甲基牛磺酸盐、烷基磺基琥珀酸钠盐、二丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸盐中的任选一种或者几种；所述乳化剂为烷基苯磺酸盐、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任选一种或者几种；所述增稠剂选用黄原胶、明胶、阿拉伯胶、瓜胶、海藻酸钠、可溶性淀粉、杂多糖、羧甲基纤维素钠、羧乙基纤维素钠、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸胺、尿素、硅酸镁铝、二氧化硅、硅藻土、膨润土和凹凸棒任选一种或者几种；所述防腐剂选用苯甲酸钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸乙酯任选一种或者几种；所述防冻剂为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇中的任选一种或者几种；所述的消泡剂为异辛醇、异戊醇、硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇醚和有机硅中任选一种或者几种。所述生防悬浮剂的制备方法，包括以下步骤:I)将所述链霉菌发酵得到的发酵液，在400(Tl0000r/min条件下离心5 20min,得到发酵菌液；2)按照所述重量百分比将所述发酵菌液、分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、消泡齐U、防冻剂和余量的水混合均匀，得到混合物料；3)将混合物料剪切分散均匀后，研磨至90%以上物料粒度度达到5Mm以下，搅拌均匀，调节PH至4.(Γ5.0,即得到生防悬浮剂。实验表明:本发明的生防悬浮剂对十字花科根肿病田间试验防治效果达55 80%，其盆栽试验防治效果为75 90%，高于氟啶胺与氰霜唑等对照药剂。
本发明的生防悬浮剂使用方法为:喷雾法:移栽前采用喷雾法进行土壤处理，按亩用所述悬浮剂1000 2000mL的使用量将所述悬浮剂稀释5(Γ200倍喷雾使用f 2次。灌根法:移栽时采用灌根法处理，将悬浮剂稀释5(Γ200倍，按每株灌根所述稀释后的悬浮液5(Tl00mL，亩用所述悬浮剂剂量为100(T3000mL，整个生长期灌根广3次。本发明还提供了一种所述链霉菌制备而成的防治十字花科根肿病的生防缓释胶囊剂及其制备方法。所述生防缓释胶囊剂包括包括广3份重量的发酵菌液、f 3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶、Γ3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠，其中，所述发酵菌液是由所述链霉菌发酵得到的菌液。所述生防缓释胶囊剂的制备方法:包括以下步骤:I)先将所述链霉菌发酵得到的发酵液，在400(Tl0000r/min条件下离心5 20min,
得到发酵菌液，取f 3份重量的发酵菌液加入反应容器；2)其次，取f 3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠加水配置成重量百分比为3 8%的水溶液后，加入反应容器，并用醋酸溶液调节反应物的PH值至3飞；3)再次，取f 3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶加水配制成重量百分比为2 8%的水溶液后，加入然应容器，继续搅拌l(T30min ；4)然后，向反应容器中中加入甲醛水溶液固化囊壁，继续搅拌l(T30min，即得微胶囊水溶液；
5)最后，将得到微胶囊水溶液离心处理后喷雾干燥后即可获得生防缓释胶囊剂。实验证明:本发明的生防缓释胶囊剂，对大白菜根肿病田间防效为65 80%，田间使用技术为大白菜或者甘蓝移栽时每穴撒施2g生防缓释胶囊剂。
图1为疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) WS-24926在ISP-2固体培养基上菌落形态。图2 为尖抱链霉菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246 在 ISP-2 上的菌落形态。
具体实施例方式为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例和说明书附图对本发明的链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用作进一步详细说明。实施例1疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei) WS-24926及尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246 菌株的分离、筛选取土样，采用常规法进行分离、纯化和保存。我们从土壤中共分离出30000株放线菌，采用先导化合物活性追踪的办法，结合HPLC-MS天然产物化合物数据库，选择相对低毒、易培养具有产业化趋势的109株放线菌，通过大白菜根肿病盆栽试验及田间试验，实验结果见表I。最终确定WS-24926及WS-29246最优，其病情指数最小，校正防效分别为95%和 79%。盆栽试验实施步骤:将各供试菌株菌种活化后，采用二级摇瓶发酵法，初级摇瓶发酵采用种子培养基，培养温度 为28°C，150rpm，二级发酵采用发酵培养基，接种量为5 10%，培养条件28°C，转速150rpm，培养时间4 6d，装液量每500mL三角瓶中装入培养液100mL。每菌株培养5瓶，每瓶装IOOmL发酵培养基。采用穴盘培养大白菜健康苗，长至2 3片真叶期供实验用。盆栽试验采用菌土法接种，将收集的大白菜根肿切碎与盆栽土按1:100 (v/v)混合均勻，装入花钵(Φ ±=15cm, Φ T =IOcm, h=13cm)中供实验用。移栽时，灌入各菌株摇瓶发酵液，每钵IOOmL,之后每隔IOd灌根I次，每次IOOmL,整个生长期共灌根4次。结果显示WS-24926及WS-29246对大白菜根肿病的防治效果最好，校正防效分别为95%和79%。根肿病分级标准:O级:没有附着根肿；I级:根肿附着在侧根上，数量占f 25% ；2级:主根上有根肿附着，侧根上根肿数量占25%以上；3级:根肿数量占5(Γ75% ;主根上有根肿附着；4级:主根上有根肿附着，根肿数量占75%以上的根系。计算公式:
权利要求
1.一种链霉菌，包括疮痂链霉菌(Sti^ptomyces scabiei ) WS-24926 CCTCC NO:M 2012393 和 / 或尖孢链霉菌(Sti^ptomyces cuspidosporus) WS-29246 CCTCC NO:M2012413。
2.—种权利要求1所述链霉菌在防治十字花科根肿病中的应用。
3.一种利用权利要求1所述链霉菌制备而成的防治十字花科根肿病的生防悬浮剂，其特征在于:所述生防悬浮剂按重量百分比由1(Γ80%的发酵菌液、0.riO%的分散剂、0.5^5%的乳化剂、0.riO%的增稠剂、0.riO%的防腐剂、(Γ3.0%的消泡剂、(Γ10.0%的防冻剂和余量的水组成，其中，所述发酵菌液是由所述链霉菌发酵得到的菌液。
4.一种利用权利要求1所述链霉菌制备而成的防治十字花科植物根肿病的生防缓释胶囊剂，其特征在于:所述生防缓释胶囊剂包括f 3份重量的发酵菌液、f 3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶、Γ3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠，其中，所述发酵菌液是由所述链霉菌发酵得到的菌液。
5.根据权利要求3所述的生防悬浮剂，其特征在于:所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、萘磺酸钠甲醛缩合物、脂肪酰胺-N-甲基牛磺酸盐、烷基磺基琥珀酸钠盐、二丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸盐中的任选一种或者几种；所述乳化剂为烷基苯磺酸盐、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任选一种或者几种；所述增稠剂为黄原胶、明胶、阿拉伯胶、瓜胶、海藻酸钠、可溶性淀粉、杂多糖、羧甲基纤维素钠、羧乙基纤维素钠、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸胺、尿素、硅酸镁铝、二氧化硅、硅藻土、膨润土和凹凸棒任选一种或者几种；所述防腐剂为苯甲酸钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸乙酯任选一种或者几种；所述的消泡剂为异辛醇、异戊醇、硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇醚和有机硅中任选一种或者几种；所述防冻剂为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇中的任选一种或者几种。
6.一种权利要 求3所述生防悬浮剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: 1)将所述链霉菌发酵得到的发酵液，在400(Tl0000;r/min条件下离心5 20min,得到发酵菌液； 2)按照所述重量百分比将所述发酵菌液、分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂和余量的水混合均匀，得到混合物料； 3)将混合物料剪切分散均匀后，研磨至90%以上物料粒度度达到5Mm以下，搅拌均匀，调节PH至4.(Γ5.0,即得到生防悬浮剂。
7.—种权利要求4所述生防缓释胶囊剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: 1)先将所述链霉菌发酵得到的发酵液，在400(Tl0000;r/min条件下离心5 20min,得到发酵菌液，取广3份重量的发酵菌液加入反应容器； 2)其次，取f3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠加水配置成重量百分比为3 8%的水溶液后，加入反应容器，并用醋酸溶液调节反应物的PH值至3飞； 3)再次，取f3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶加水配制成重量百分比为2 8%的水溶液后，加入然应容器，继续搅拌l(T30min ； 4)然后，向反应容器中加入甲醛水溶液固化囊壁，继续搅拌l(T30min，即得微胶囊水溶液； 5)最后，将得到微胶囊水溶液离心处理后喷雾干燥处理，即可获得生防缓释胶囊剂。
全文摘要
本发明公开了一种链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用，该链霉菌菌种包括疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926 CCTCC NOM 2012393和/或尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246 CCTCC NOM 2012413。所述链霉菌经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的发酵菌液，该发酵菌液可用于制备抗植物十字花科根肿病的生防悬浮剂和生防缓释胶囊剂，用于十字花科根肿病的生物防治。
文档编号A01N25/04GK103173385SQ20131004974
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者龙同, 万中义, 王开梅, 杨自文, 曹春霞, 张志刚, 张亚妮, 闵勇, 廖先清, 方伟, 江爱兵, 朱志刚, 姚经武, 张遵霞 申请人:湖北省生物农药工程研究中心