专利名称：水稻抗稻瘟病基因pi5共显性标记及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物。
背景技术：
稻痕病(Pyriculariagrisea cav.)是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;无性态:Pyri cu I aria)引起的水稻病害,其分布范围十分广泛。据统计,全世界有80余个国家均有发生，一般流行年份可造成10 % -20 %的减产，严重发生时则达到40 % -50 %。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，每年损失稻谷达数亿千克。随着品种应用的单一化、集中化以及气候的影响，稻瘟病的危害也越来越重。尽管人们在病害防治上耗费了巨大的精力和物质投入，但限于诸多方面因素的影响，防病效果一直不尽人意，尤其在病害严重发生年份，常常给生产、育种造成重大损失。以辽宁省为例，自20世纪90年代起，分别发生了因辽粳287、辽盐241、辽粳454和辽星I号几个主栽品种抗病性退化导致的穗颈瘟大面积发生，严重影响了北方粳稻的生产。产生这种现象的根本原因就是主栽品种对稻瘟病菌的抗谱狭窄，且单一化、集中化种植现象普遍，这样一旦稻瘟菌流行小种发生变化，品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，选育聚合多基因或具广谱抗性的水稻品种尤为必要。目前，在抗稻瘟病品种选育的过程中，育种家主要采用系谱法，或结合分子标记辅助选择抗病个体。传统的系谱法通过两亲本组配，从分离后代中择优选育品种，抗瘟表型依赖于田间自然鉴定或人工接种鉴定，鉴别难度大，准确率低。由于不了解亲本的抗瘟基因型，育种者在亲本选择上非常盲目，通常是海量配组，海量选择后代，工作量大，育种效率低。在利用分子标记辅助选择 进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连锁的SSR标记，易造成假阳性的判断，如能根据抗感等位基因本身的序列差异来设计不同基因的共分离标记，不仅可首先检测亲本所携带的抗瘟基因，也能在后代辅助选择时大大提高抗性品种选择的准确性。水稻抗稻痕病基因Pi5 (Jeon J S, et al.Genetic and physical mappingof Pi5 (t), a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast.Molecular Genetics and Genomics,2003,269(2):280-289 ；ffang G L, et al..RFLPMapping of Genes Conferring Complete and Partial Resistance to Blast in aDurably Resistant Rice Cultivar Genetics, 1994,136 (4): 1421-1434)位于水稻第 9 染色体上S04G03和C1454之间的170kb区间内，包含两个独立遗传的NBS-LRR类基因(Pi5_l和Pi5-2)，且两个基因的蛋白产物在氨基端都有CC结构。Pi5-1和Pi5-2分别有5和6个外显子，蛋白产物分别含有1025和1063个氨基酸；基因表达分析表明Pi5-1受病原菌诱导表达，而Pi5-2是组成性表达，在温室人工接种条件下对P06-6等5个稻瘟病小种表现完全抗性，Pi5基因原始抗性供体为RIL260 (Wang G L, et al..RFLP Mapping of GenesConferring Complete and Partial Resistance to Blast in a Durably Resistant RiceCultivar Genetics,1994,136(4):1421-1434)。
发明内容
为了高效选择抗稻瘟病水稻品种，有针对性的、特异性的选择含Pi5基因的后代材料，本发明提供一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pi5的分子标记pi5-l-4，该分子标记根据Pi5基因序列在抗感等位基因间的序列差异设计，可以用于Pi5基因的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。本发明提供如下解决方案:一种与水稻抗稻瘟病基因pi5连锁的分子标记pi5-l_4，如SEQ ID NO:3所示，所述分子标记pi5-l-4与水稻抗稻瘟病基因pi5紧密连锁。一种用于检测分子标记pi5-l-4是否存在的引物对DNA，如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示。一种检测水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物，扩增待检测DNA，扩增子含有如SEQ ID NO:3所示序列即为含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。更进一步的，扩增子含有如SEQ ID NO:4所示序列即不含有水稻抗稻瘟病基因Pi5而含有其感病等位基因，即扩增子含SEQ ID NO:4所示序列的待测DNA不含水稻抗稻瘟病基因pi5。一种抗稻瘟病水稻品种分子标记辅助选择方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料为亲本，与其他水稻品种杂交，提取杂交后代个体基因组DNA，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列为引物进行PCR扩增，扩增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的对应个体即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。上述引物对优选对水稻苗期所提取的DNA进行标记鉴定，检测是否携带抗稻瘟病基因Pi5，由于上述引 物对是基于基因组序列的插入缺失多态性设计的，因此检测方便，准确率高，该分子标记可以作为水稻稻瘟病抗病育种中Pi5基因分子标记辅助选择的应用。
图1是分子标记pi5-l_4在抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260和6个高感水稻品种中扩增产物的凝胶电泳图；其中，M:1500bp分子量标记(TIANGEN MD109-02)，200ng ;片段长度分别为:IOObp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,lOOObp,1500bp。I:RIL260 ；2:丽江新团黑谷；3:辽盐241 ；4:辽星I号；5:盐丰47 ；6:日本晴；7:
丰锦其中抗病基因供体品种RIL260扩增产物片段大小为1105bp，而感病等位基因扩增产物片段长度为1266bp。图2是分子标记pi5-l_4在抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260、pi5单基因系(从IRRI引进)及18个水稻品种中扩增产物的凝胶电泳图。其中，M:1500bp分子量标记(TIANGEN MD109-02)，200ng ;片段长度分别为:1OObp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,lOOObp,1500bp。I:RIL260 ；2:丽江新团黑谷；3:辽粳454 ；4:辽粳294 ；5:辽粳371 ；6:沈农265 ；7:千重浪2号；7:秋光；8:辽粳101 ；9:辽开79 ；10:盐粳456 ；11:沈稻7 ;12:越光；13:辽农979 ；14:港源8号；15:屉优418 ；16:港育129 ；17:辽星20 ；18:丰锦；19:pi5单基因系；20:港 556。其中13号品种辽农979经检测，带型与pi5单基因系和供体品种RIL260 —致，确定携带抗稻瘟病基因pi5。图3SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4的多态比较结果。其中阴影部分为SEQ ID NO:4在SEQ ID NO:3中的插入序列。
具体实施例方式
实施例1:DNA提取、PCR扩增和电泳分析一、DNA 提取(CTAB 法):称取0.1 0.2g水稻叶片并剪成Icm长，在液氮中研磨，待液氮蒸发完后(注意:勿使样品融化)，迅速转入含65°C预热过的提取液(1M Tris pH8.0, IOOmM ；5M NaCl, 1.0M ；
0.5M EDTA,20mM ；10% CTAB, 2.0% )400 μ L 的离心管中。轻轻摇匀。60 65°C水浴30 60分钟，每10分钟轻轻摇动均匀。加等体积的氯仿/异戊醇(24: I)，温和摇动，使成乳状液。室温下(温度不低于15°C ), 12000r/min离心5min,取上清液。
用大孔Tip头小心抽取上清液200 μ L加入预冷的2倍体积的无水乙醇(或等体积的异戊醇)，-200C的条件下放置20分钟以上，5000r/min离心5分钟，收集沉淀。70 %乙醇洗涤沉淀I 2次。打开管盖，放洁净场所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。100 μ LTE (Tris-HclIOmM, PH8.0 ；EDTAlmM, PH8.0)溶解沉淀，并稀释至 100 μ g/mL，-20°C保存备用。二、PCR 扩增:PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。1.反应体系如下:2 X Taq PCR Master Mix (艾德莱 PC0902) 10 μ L，10 μ M 的引物各 0.5 μ L，100 μ g/mL 的模板 DNAl μ L, ddH208 μ L。3.PCR 反应程序为:94°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 70s，35个循环，72°C延伸10min，4°C保存。三、PCR产物检测取4μ L PCR产物，在1%琼脂糖凝胶中电泳，经goldview染色，应用凝胶成像系统记录试验结果。实施例2:供体品种中抗病基因与感病品种中等位基因间的多态性分析以抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260和6个高感水稻品种(丽江新团黑谷；辽盐241 ;辽星I号；盐丰47 ；日本晴；丰锦)为试材，种植于温室。将辽宁地区流行的稻瘟病菌ZA9、ZA33、ZB1和ZB17分别移植于燕麦片番茄汁琼脂培养基上，25 27°C条件下培养5 7d，待菌丝长满，用灭菌的棉签擦掉气生菌丝后保湿培养，稻瘟病菌会大量产孢。待7个品种稻苗长至5叶I心时，将上述扩繁培养的各菌株分生孢子分别用120ml无菌水清洗，用双层纱布过滤装入三角瓶中，配制孢子悬液(浓度为120倍显微镜视野下有20个左右孢子)，分别隔离喷雾接种。接种后24h，用塑料膜覆于塑料盘上方的铁架上保湿，在塑料膜上覆盖遮阳网防止阳光直射。于接种后IOd调查，致病反应型和小种确定按全国稻瘟病菌生理小种联合试验组(1980)统一标准进行评定。调查记载标准:O级无病..............................................................................高抗(HR)I级仅有针尖大小的褐点...............................................................抗(R)2级稍大的褐点........................................................................抗(R)3级圆形稍大的灰色小病斑，边缘褐色，病斑直径I 2_...............中抗(MR)4级典型纺锤形病斑，长I 2cm，通常局限于两条主脉之间。为害面积2%以下...................................................................................................顿(MS)5级典型病斑，为害面积3% 10%..........................................中感(MS)6级典型病斑，为害面积11% 25%................................................感(S)7级典型病斑，为害面积26 % 50 %...................................................感(S)8级典型病斑，为害面积51% 75%..........................................高感(HS)
9级全部叶片枯死...............................................................高感(HS)接种鉴定结果表明，抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260对辽宁地区流行的4个稻瘟病菌生理小种表现为抗病(R)，而丽江新团黑谷、辽盐241、辽星I号、盐丰47、日本晴、丰锦6个水稻品种对ZA9、ZA33、ZBl和ZB17均表现为感病(S)。在苗期按实施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增，扩增结果如图1所示:Pi5供体品种RIL260的扩增产物长度约为llOObp，经测序分析，表明产物片段长为1105bp，经序列分析如SEQ ID N0:3所示。而另外6个感病品种扩增产物片段稍长，约为1260bp，经测序表明，产物片段长为1266bp JBSEQ ID NO:4所
/Jn ο以上结果表明，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增的片段可以做为检测抗稻瘟病基因Pi5是否存在的标记。含有约IlOObp片段的品种可确定为携带抗稻瘟病基因Pi5，而产物片段稍大一些的(1260bp左右)品种不携带该抗病基因。结论:用该标记可以可靠地的检测抗稻瘟病基因pi5的存在。实施例3:利用分子标记pi5-l_4检测育种亲本材料是否携带抗稻瘟病基因pi5。以抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260、pi5单基因系(从IRRI引进)及18个水稻品种为试材，正常栽植于温室，于苗期按实施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增，20个品种扩增结果如图2所示，除抗稻瘟病基因Pi5供体品种RIL260外，pi5单基因系(从IRRI引进)和13号品种辽农979扩增产物带型与供体品种一致，进一步测序结果表明，扩增产物序列与SEQ ID NO:3所示序列一致。而其余17个品种虽然也存在PCR扩增产物，但产物片段较RIL260、pi5单基因系和辽农979稍大(如图2所示)，进一步测序结果表明，扩增产物序列与SEQ ID NO:4所示序列一致。接种鉴定结果表明，辽农979对辽宁地区流行的4个稻瘟病菌生理小种表现为抗病(R)。基于分子标记鉴定的结果可确定这3个品种含有抗稻瘟病基因pi5。基因检测表明，辽农979含pi5基因。
结论:该标记可以高效地用于抗稻病育种中亲本及后代材料抗稻瘟病基因pi5的
鉴定。
权利要求
1.一种检测水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列为引物，扩增待检测DNA，扩增子含有如SEQ ID NO:3所示序列即为含有水稻抗稻瘟病基因pi5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增子含有如SEQID NO:4所示序列即不含有水稻抗稻瘟病基因Pi5而含有其感病等位基因。
3.一种抗稻瘟病水稻品种分子标记辅助选择方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料为亲本，与其他水稻品种杂交，提取杂交后代个体基因组DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列为引物进行PCR扩增，扩增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的对应个体即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。
4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于，扩增子含有如SEQID NO:4所示序列即不含有水稻抗稻瘟病基因Pi5而含有其感病等位基因。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物。所述分子标记是一种水稻抗稻瘟病基因pi5的共显性分子标记pi5-1-4，它是用引物对SEQ ID NO1和SEQ ID NO2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，可以应用于水稻稻瘟病抗性育种中pi5的分子标记辅助选择，以提高抗病品种选育的效率，减少田间鉴定的工作量。
文档编号A01H1/04GK103215369SQ20131016446
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者郑文静, 陆晓春, 赵家铭, 王妍, 张丽霞, 丛玲 申请人:辽宁省农业科学院, 郑文静, 陆晓春