参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220及其应用，它是首次在黄瓜基因组中发现的控制苦味合成的两个bHLH转录因子（Csa5G157230和Csa5G156220）之一，两个bHLH转录因子分别在果实和叶片中控制苦味的形成。利用酵母单杂交、凝胶组织体系和烟草瞬时表达证明了这两个转录因子能够结合到与苦味合成启动子区域结合并激活合成基因的转录；同时在无苦味的黄瓜叶片或果实中大量表达对应的转录因子能够恢复黄瓜植株的苦味性状。本发明进一步揭示了黄瓜苦味形成的分子机制，为无苦味黄瓜育种提供了理论依据和分子辅助育种目标。
【专利说明】参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220及其应用。
【背景技术】
[0002]黄瓜的苦味是由一类称为葫芦素C的三萜化合物导致的。黄瓜果实中积累葫芦素C会严重影响黄瓜的口感及品质。早期的经典遗传学试验发现黄瓜的苦味由Bi和Bt两个基因控制。最近研究发现一个由8个基因组成的基因簇参与黄瓜苦味的合成。其中Bi基因编码氧化角鲨烯环化酶，它催化生成葫芦2烯醇，是葫芦素C合成的第一步，也是合成中最关键的一步。
[0003]尽管已经基本确定了黄瓜中苦味合成的分子机制，但调控苦味形成的分子机制目前还不清楚，相关合成基因也未被克隆。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220及其应
用。
[0005]为了实现本发明目的，本发明的一种参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]本发明还提供编码所述转录因子Csa5G156220的基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0007]本发明还提供含有编码所述转录因子Csa5G156220基因的载体、工程菌、宿主细胞及转化的植物。
[0008]本发明还提供编码所述转录因子Csa5G156220的基因在调控黄瓜苦味合成中的应用。
[0009]本发明还提供编码所述转录因子Csa5G156220的基因在无苦味黄瓜分子育种中的应用。
[0010]本发明还提供一种在植物中瞬时表达基因的方法，采用农杆菌介导的方法，将含有编码所述转录因子Csa5G156220基因的载体转入植物体(如烟草)中，获得目的基因大量表达。
[0011]本发明进一步提供用于PCR扩增编码所述转录因子Csa5G156220基因的引物对，包括上游引物5 ' -TCTCTTTCCTCTCTCATTACGGGTGA-3 '和下游引物5' -CGCACATCAAGGCAATCAACTCG-3'。
[0012]从来自湖南的一个叶片无苦味的黄瓜突变体(XY - 3)，它是由苦味黄瓜(XY - 2)自然突变而来。在突变体XY - 3中，检测了之前发现的苦味合成基因的表达，发现苦味合成基因簇在突变体中的表达量非常的低。由此推测该突变体中调控苦味合成的基因可能发生了突变。将XY — 2和XY — 3的基因组DNA进行测序。通过比较基因组序列，重点寻找发生在转录因子的内部突变。通过分析，找到一个SNP，位于Csa5G156220这个转录因子的内部。结合转录组数据，发现该基因只在叶片中大量表达。进一步检测该基因在突变体XY —3中的表达，发现该转录因子在突变体中的表达也大幅降低。此外，还发现干旱以及ABA等逆境处理都可以使该转录因子及苦味合成基因表达升高，具有很高的一致性。因此，推测该突变可能导致该转录因子表达量降低，从而使合成基因表达大幅降低，最终导致了叶片从苦变为不苦。
[0013]为了进一步验证，进行了酵母单杂交和凝胶阻滞实验，证明该转录因子的确能够结合到苦味合成基因的启动子区域。此外，还将苦味合成基因的启动子连上报告基因(LUC)，在烟草中检测转录因子对启动子区域的激活作用，发现它可以激活报告基因的表达。由于稳定的黄瓜转基因体系还不成熟，因此，本发明建立了黄瓜子叶瞬时表达系统，利用农杆菌将转录因子导入黄瓜XY - 3的无无苦味子叶中，一周后检测子叶，发现转录因子和合成基因大量表达，从而导致子叶由不苦变成苦。综合上述研究结果，本发明首次发现了在叶片中调控苦味合成基因表达的转录因子。将该基因命名为Bf，它通过调控合成基因的表达从而进一步调控叶片苦味的形成。
[0014]之前的遗传分析发现黄瓜果实基因是由Bt基因控制。由于野生黄瓜果实非常的苦，因此在黄瓜驯化过程中，Bt基因必然发生了突变，导致黄瓜果实不苦，该突变受到人为选择而保留下来。在之前的研究中，对114份黄瓜核心种质材料进行重测序分析，通过生物信息学分析黄瓜驯化发生的区域，再结合图位克隆，将Bt基因定位到5号染色体442kb的区间内。此区间有68个候选基因。进一步分析这些基因的转录组数据，发现其中Csa5G157230只在野生黄瓜的果实中表达，在栽培黄瓜果实中不表达。并且Csa5G157230基因与同时发现的调控叶片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH类转录因子。通过检测Csa5G157230基因和苦 味合成Bi基因在不同黄瓜品种中以及Bt基因分离群体个体中的基因表达情况。发现它们的表达量与果实中苦味素的含量呈正相关。即Csa5G157230基因的表达量越高，则Bi基因表达量越高，从而黄瓜果实越苦。根据这些信息，推测这个基因很有可能就是Bt基因，它通过类似Bf调控苦味合成的机制调控黄瓜果实中的苦味合成。
[0015]基于之前已报道的研究体系，如酵母单杂交、凝胶阻滞证明Csa5G157230基因的确可以转录激活苦味合成基因的表达。由于稳定的黄瓜转基因体系还不成熟，因此本发明建立了黄瓜果实瞬时表达系统，利用农杆菌将Csa5G157230基因导入新泰密刺果实中，三周后检测注射区域的果实，发现Csa5G157230基因和合成基因大量表达，从而导致果实由不苦变成苦。综合上述研究结果，认为Csa5G157230基因即为Bt基因。它通过调控合成基因的表达从而进一步调控果实苦味的形成。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例1中涉及的XY-3无苦味突变体相关信息；其中，A为突变体中葫芦素C的相对浓度，XY-2为苦味黄瓜；B为突变体中苦味合成基因的表达情况；C为重测序发现突变的位置位于Bf转录因子的内部。
[0017]图2为本发明实施例1中用干旱和ABA处理后Csa5G156220及苦味合成基因的表达情况。
[0018]图3为本发明实施例1中用生物信息学分析结合图位克隆，将Bt基因定位于5号染色体的情况；其中，有67个候补基因，它们在野生和栽培黄瓜果实及叶片中的表达用渐变色区分，越深代表含量越高。
[0019]图4为本发明实施例1中检测不同种类的黄瓜以及Bt分离群体中的个体中苦味合成基因B1、苦味调控基因Bt的表达及葫芦素C的含量。
[0020]图5为本发明实施例1中用酵母单杂交系统和烟草瞬时表达系统证明Bf可以结合到苦味合成基因的启动子上，并激活下游报告基因转录。
[0021]图6为本发明实施例1中用凝胶阻滞系统证明Bf可以结合到苦味合成基因的启动子上。
[0022]图7为本发明实施例1中用酵母单杂交系统和烟草瞬时表达系统证明Bt可以结合到苦味合成基因的启动子上，并激活下游报告基因转录。
[0023]图8为本发明实施例1中用凝胶阻滞系统证明Bf可以结合到苦味合成基因的启动子上。
[0024]图9为本发明实施例2中分别用叶片和果实瞬时表达系统来证明Bf和Bt的生物学功能，当Bf或Bt表达后导致苦味合成基因Bt表达升高，最终使苦味物质葫芦素C的含 量升高。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0026]实施例1调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子挖掘与获得
[0027]1、候补基因的挖掘
[0028]在湖南发现了一个叶片无苦味的黄瓜突变体(XY - 3)，它是由苦味黄瓜(XY - 2)自然突变而来(图1，A)。在突变体XY - 3中，苦味合成基因簇在突变体中的表达量非常的低(图1，B)，推测该突变体中调控苦味合成的基因可能发生了突变。将XY — 2和XY — 3的基因组DNA进行重测序。利用生物信息学分析，寻找发生在转录因子的内部突变。该分析找到一个SNP，位于Csa5G156220这个转录因子的内部(图1，C)。转录组数据显示该基因只在叶片中大量表达，且该转录因子在突变体中的表达也大幅降低(图1，B)。此外，干旱以及ABA等逆境处理都可以使该转录因子及苦味合成基因表达升高(图2)。因此，将该转录因子列为候补基因，命名为Bf。
[0029]之前的遗传分析发现黄瓜果实苦味是由Bt基因控制。在黄瓜驯化过程中，Bt基因必然发生了突变，导致黄瓜果实不苦。对114份黄瓜核心种质材料进行重测序分析，通过生物信息学分析黄瓜驯化发生的区域，再结合图位克隆，将Bt基因定位到5号染色体442kb的区间内。此区间有68个候选基因(图3)。进一步分析这些基因的转录组数据，发现其中Csa5G157230只在野生黄瓜的果实中表达，在栽培黄瓜果实中不表达(图3)。检测Csa5G157230基因和苦味合成Bi基因在不同黄瓜品种中以及Bt基因分离群体个体中的基因表达情况。发现它们的表达量与果实中苦味素的含量呈正相关(图4)。即Csa5G157230基因的表达量越高，则Bi基因表达量越高，从而黄瓜果实越苦。并且Csa5G157230基因与我们发现的调控叶片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH类转录因子。根据这些信息，推测这个基因很有可能就是Bt基因，它通过类似Bf调控苦味合成的机制调控黄瓜果实中的苦味合成。
[0030]2、黄瓜Csa5G156220基因功能验证
[0031 ] 首先制备黄瓜叶片和果实的cDNA文库，然后利用正向引物和反向弓丨物进行PCR扩增(引物序列见表1)。
[0032]表1引物序列(5' -3')
[0033]
【权利要求】
1.参与调控黄瓜葫芦素C合成的转录因子Csa5G156220，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述转录因子Csa5G156220的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
6.权利要求2或3所述基因在调控黄瓜苦味合成中的应用。
7.权利要求2或3所述基因在无苦味黄瓜分子育种中的应用。
8.一种在植物中瞬时表达基因的方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求4所述的载体转入植物体中，获得目的基因大量表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于黄瓜、烟草。
10.用于PCR扩增权利要求2或3所述基因的引物对，其特征在于，包括上游引物5' -TCTCTTTCCTCTCT CATTACGGGTGA-3'和下游引物 5' -CGCACATCAAGGCAATCAACTCG-3'。
【文档编号】A01H5/00GK103755791SQ201310701069
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】黄三文, 尚轶, 张慧明, 陈惠明, 张忠华 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所