专利名称：葫芦素新的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及已知物质葫芦素新的医药用途，即葫 芦素B、葫声素B类物质及葫芦素BE的新用途。具体地说，系指葫芦素B、 葫芦素B类物质与葫芦素BE、葫芦素I、葫芦素Q及其药学组合物在治疗
卵巢癌、提高放射治疗患者的白血球数量药物中的新用途。也可以是葫芦 素B单体、异葫^素B单体、双氢葫芦素B单体、葫芦素I单体、葫芦素
Q单体。
背景技术：
葫芦素(C丽bitacins)属于19-甲基出现在C-9位上的一类四环三萜 化合物，主要分布于葫,科植物中，在十字花科、玄参科、秋海棠科、杜 英科、四数木科等高等植物及一些大型真菌中也有发现。中国科学院昆明 植物所研究员邱明华带领科技人员在发现的一系列新型葫芦素的基础上， 研究了 229个几乎所有的葫芦素类化合物，提出了新的结构分类模式，由 此前的5类结构类型重新分为12类，得到了国际学术界的认可。目前，我 国批准生产的葫，素又叫葫芦素BE，为中药甜瓜蒂(别名苦丁香)提取 物，主要含葫芦素B、 E等成分，现有的提取物中葫芦素B含量为60%以上，
其质量标准收载于我国部颁标准中。葫芦素片用于治疗慢性肝炎(葫芦素片 药学通报1986,21 (6):357),经上海、北京、重庆等地十三家医院临床， 其有效率为75.2%,显效率为44.6%。临床上观察到葫芦素片能较全面地改 善慢性肝炎常见症状和主要体征，并有明显的降酶(S-GPT)、降浊(TTT、 ZnTT)和降胆红质作用，停药后不引起S-GPT反跳，对蛋白倒置和高球蛋 白血症也有明显的纠正作用，还能提高慢性肝炎患者的非特异性细胞免疫 能力，无明显毒副作用。除此而外，葫芦素片还能用于治疗原发性肝癌， 经上海、北京、广西等地六家医院临床观察，统计169例，有效率69%, 显效率39%。临床观察表明，该药与5-氟脲嘧啶比较，其改善症状、消除 肝痛、缩小瘤体、延长生存期、恢复体力等，均优于对照组，且无一般化 疗药物的毒副作用(治疗肝炎、肝癌新药葫芦素片，中草药，1987,18(10): 21;葫,素治疗原发性肝癌5 O例临床观察，新药与临床，1984,3 (2): 21-22;葫,素的药理与临床应用，中草药，1992, 23 (11):605 ~ 608)。
最近有作者将葫芦素片与化疗药联合，治疗中晚期肝癌，中位生存期由单 一化疗药的6. 1±7. 12月,提高到12. 5 ±7.54月(葫芦素片加化疗药治疗 中晚期原发性肝癌的临床疗效观察，癌症，1989, 8 (6) :434-436 );另有文 献发现葫芦素B,E对鼻咽癌细胞具有较强的杀伤作用；有文献指出，长疗 程用药(6周)能明显抑制肝纤维组织增生，防止肝脂肪变性以及肝硬变的 形成和发展。现有专利多为与剂型相关的专利，如"纳米葫芦素制剂药物 及其制备方法，申请号01103658. 3"、"葫芦素环糊精包合物及其制剂， 申请号02153647. 3 "、"葫芦素脂质体组方及其制剂，申请 号02144633. 4"、"葫^素滴丸及其制备方法，申请号200310100943. 3" 最近公开了一项新用途专利"200610046738.7",将葫芦素用于升白和与化疗药物联合治疗，逆转化疗药物的降白作用；专利"CN200710011515.1" 申请将"葫芦素"、"瓜蒂素"用于治疗喉癌。但未见将其用于卵巢癌及与 卵巢癌放化疗结合提髙疗效，降低毒副作用，特别是升高化疗患者白细胞 的报道。
卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子 宫体癌而列居第三位。临床上可出现下腹不适、腹痛、腹部肿块、月经紊 乱、压迫等症状。有起病隐匿，早期不易发现，易转移，预后差等特点。 占所有妇科恶性肿瘤的15%左右。因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的 首位，对妇女生命造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育，组织解剖及内分 泌功能较复杂，它所患的肿瘤可能是良性或恶性。目前卵巢恶性肿瘤治疗 以手术为主合并化疗、放疗的综合治疗。化疗主要采用顺铂加环磷酰胺 (cp),或顺钼加环磷酰胺加阿霉素(cap)方案。或者长春新碱加博来霉素、 加顺钼(vbp)、博来霉素加足叶乙甙加顺铂(bep)及长春新碱加更生霉素加 环磷酰胺(vac)等方案，或者足叶乙甙加卡铂(vc)，氨甲喋吟加更生霉素加 瘤可宁(mkc)等方案。这些方案均存在一些严重的毒副作用，如白细胞下降、 肾脏毒性。另外，也可以采用放疗。放疗也存在白细胞下降的毒性问题。
CA125是一种糖蛋白，广泛存在于间皮细胞组织中，是目前最广泛最 深入的一种卵巢癌相关抗原。CA125在非黏液性卵巢癌和上皮细胞性卵巢 癌细胞株上表达，正常或良性卵巢组织中不表达。CA125在血清中浓度高
低与卵巢癌的发生及愈后发展密切相关。卵巢浆液性腺癌患者阳性率为 82%,在III-IV期病变阳性率可达100%。因此卵巢癌患者治疗后定期监测 CA125可以预期复发或转移。
至今未见葫^素B、葫芦素B类物质及葫芦素BE在用于卵巢癌方面的 应用，也未见葫芦素，包括葫芦素B、葫芦素B类物质(如双氢葫芦素B、 异葫芦素B)及葫声素BE、葫芦素I、葫芦素Q或者其中的一种或者多种成 分葫芦素用于降低卵巢癌患者血清CA125,也未见葫芦素粗提物一瓜蒂素 用于降低卵巢癌患者血清CA125。
发明内容
本发明提供了一种同时具备治疗卵巢癌作用和提高白细胞的药物，即以 葫芦素来治疗卵巢癌、提高放射治疗患者的白血球数量及含有葫芦素的用 于治疗卵巢癌及提高放射治疗患者白血球数量的药学组合物。葫芦素和其 药学组合物可以用来制备治疗卵巢癌的药物及降低卵巢癌患者血清CA125 的药物。
葫芦素为葫芦科植物、十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数
木科植物及一些大型真菌中提取的一类四环三萜化合物；还包括粗提物一 瓜蒂素。
葫芦素主要成分为葫芦素B,尚可以包括葫芦素E、异葫芦素B、双氢 葫,素B、葫，素I、葫,素Q其中的一种或者多种成分；作为组合物时， 葫声素B含量大于30%。也可以是葫芦素B单体、异葫芦素B单体、双氢 葫,素B单体、葫芦素I单体、葫芦素Q单体部分葫芦素单体的化学结构式如下:
<formula>formula see original document page 5</formula>H。" "X^、 C08805
葫芦素Q 葫芦素S
以葫芦素或其药用组合物作为主要成分的药物可以制备成包括固体制 剂、半固体制剂、液体制剂在内的多种剂型，如片剂、胶囊剂、散剂、颗
粒亦]、混悬剂、糖浆剂、软膏剂、贴剂、口服液、气雾剂、注射剂，也可 以制成脂质体、微球、纳米粒、乳剂等特殊剂型。给药途径包括口服、外 用、腔道给药和注射。可以单独给药或者联合治疗，用于肿瘤患者因为化 疗、放疗造成的白细胞低下症。葫芦素给药剂量按照总葫芦素计算，小鼠 以0.001 mg /公斤-1 mg /公斤体重给药，健康成人用剂量为0. lmg-5mg/ 曰；最佳剂量分别为小鼠O. 01 mg /公斤-0. 5 mg /公斤体重给药，健康成 人用剂量为0. 3mg-3mg/日，分1次-4次给药。
图1为实施例1中葫芦素B体外对卵巢癌细胞SK-OV-3的增殖的影响
具体实施例方式
本发明的详细组分由下列实施例给出，但本发明的保护范围，不仅局限 于此。 实i例1:
葫芦素B (CuB, HPLC面积归一化法测定的纯度大于99%)体外抗人卵巢癌 细胞研究
一、体外实验(MTT) 方法
1. 将人卵巢癌细胞SK-0V-3用含10 %胎牛血清的RPMI1640培养液培 养，虹37 'C、 5 %C02培养箱中，每3~4天传代1次。逸对数生长斯的细
ik用于实验。
2. 贴壁细胞用0. 25%胰酶(含EDTAlmM/L)'消化后悬浮于培养液中，调 细胞浓度为2.5 xl07 mL ，按每孔100jLiL接种于96孔板上，每孔设3 个复孔。空白对照孔(blank)只加培养液。
3. 培养18-24h待细胞贴壁后，分组加入不同浓度药物(0.5nL),另 一M为对照组(不加药)。
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64. 继续培养24、 48或72小时,每孔加入5 mg/ mL MTT试剂10 y L , 继续培养4小时，每孔加入10%SDS (含10mM/L盐酸)100|aL,培养箱内过夜。
5. 用酶标仪(570nm波长)测每孔的OD值。根据OD值求出Hep-2细 胞抑制率，计算公式为抑制率(inhibit rate ，_ IR)=[(对照组OD值均数 -blank组OD值均数)-(实验组OD值均数-blank组OD值均数)]/ (对 照组OD值均数-blank组OD值均数)。
即l-( OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白) 结果见图1。
葫声素B对卵巢癌的IC50 23. 3 iamol (24h) 、 1. 55 |a mol (48h) 0.79 lamol(72h);而阿霉素对卵巢癌的IC50为10.99jumo1 (48h)
同样，我们测定了作用24小时双氢葫芦素B (HPLC面积归一化法测定 的纯度大于95%)、异葫芦素B (HPLC面积归一化法测定的纯度大于95%)、 葫声素Q (HPLC面积归一化法测定的纯度大于90。/。)、葫,素I (HPLC面积 归一化法测定的纯度大于90%)对卵巢癌的IC50分别为16.6Mmol (24h) 11.8 m mol (24h)、 18.2,1 (24h)和21. 8 ja mol (24h)。 实施例2:
葫芦素B (CuB, HPLC面积归一化法测定的纯度大于98%)裸鼠体内抗 卵巢癌细胞SK-OV-3药效学研究 方法
18-20克裸鼠(BALB/C，5-6周，雌性，购自中国医学科学院中国协和 医科大学实验动物研究所MO只，右侧腋下接种细胞5x107只，待瘤块 生长到大于60mm3时，随机分为4组，分别为阴性对照组(0， 9 %氯化钠， 0.2ml/只.天，静脉注射)，CuB低剂量组(50pg/kg'天，静脉注射)、中 剂量组U00jug/kg 天，静脉注射)、高剂量组(200jag/kg .天，静脉注 射)，连续给药14天。最后一次给药后24小时内处死动物，取肿瘤称重。 计算抑瘤率。结果分别为26%、 41%、 56%。
另外，所有4组试验组的白细胞数(xl09 'L")依次分别为7.1 ±0.5, 7. 5 ±0.7, 7.0 ±0.8， 6. 8 ±0,8,即本品在治疗肿瘤时并未引起小鼠白细 胞下降，是现有抗肿瘤药物所不具备的特点。
备注静脉注射的葫芦素B制剂是脂质体制剂，其制备方法见专利 "200610046738.7"。 实施例3:
双氢葫芦素B (HPLC面积归一化法测定的纯度大于95%)裸鼠体内抗 卵巢癌细胞SK-0V-3药效学研究 参见"实施例2"的方法
18-20克裸鼠18只，右侧腋下接种细胞5x107只，待瘤块生长到大 于50mra3时，随机分为3组，分别为阴性对照组(蒸馏水，灌胃，0. 2ml/ 只'天)，双氢葫芦素B组(灌胃给药，300Mg/kg 天)、双氢葫芦素B组 (灌胃给药，40(^g/kg'天)，连续给药14天。最后一次给药后24小时抑瘤率。结果双氢葫芦素B组的抑瘤率分别
为39.2%和51.6%;与正常对照组相比，治疗组小鼠的体重和白细胞均未明
显改变。
实施例4:
异葫声素B (HPLC面积归一化法测定的纯度大于90%)裸鼠体内抗卵巢癌细胞SK-0V-3药效学研究
方法同"实施例3"。给药剂量为300网/kg 天，灌胃给药，连续给药14天抑瘤率为50. 3%。实施例5:
葫芦素与放疗的联合治疗作用
葫声素BE (其中葫芦素B含量为93. 1%,余下成分主要为葫芦素E)脂质体(制备方法见专利"200610046738. 7")联合放射治疗提高疗效。试验分三组，第一组为单纯放射治疗组，600拉德照射；第二组为单纯脂质体组，髙、中、低剂量分别为100ng/kg、 50 pg/ kg、 25|ag/ kg;第三组为联合组。给药途径静脉注射；给药方案每天一次，共治疗10天；结果第一组的抑瘤率为26%;第二组的抑瘤率分别为46%、 33%、 22%;第三组联合治疗，抑瘤率分别提高为68%、 61%、 46%;白细胞(x 109 L—"分别为第一组，3.2;第二组，6.8、 7.6、 7.1;第三组，6.1、 5.9、 6.2;正常组7. 7。实施例6
异葫，素B (HPLC面积归一化法测定的纯度大于95%)联合阿霉素在裸鼠体内抗卵巢癌细胞SK-0V-3药效学研究参见"实施例2"的方法
18-20克裸鼠20只，右侧腋下接种细胞5x107只，待瘤块生长到大于50mm3时，随机分为4组，分别为阴性对照组(蒸馏水，灌胃，0. 2ml/只-天)，阿霉素组(5mg/kg，静脉注射，隔日注射，共给药4次)；双氢葫芦素B组(灌胃给药，300pg/kg 天)、联合组(阿霉素5mg/kg,静脉注射，隔曰注射，共给药4次；双氢葫芦素B组灌胃给药，30Q)ug/kg 天，连续给药14天)。最后一次给药后24小时内处死动物，取肿瘤称重，计算抑瘤率。结果阿霉素组的抑瘤率为43.8%,双氢葫芦素B组的抑瘤率为38.3%,联合组的抑瘤率为67.6%;与正常对照组相比，阿霉素组小鼠的体重明显下降；双氢葫芦素B、联合治疗组小鼠的体重未明显改变。阴性对照组、阿霉素组、双氢葫芦素B组、联合组的白细胞(x 109 L—"分别为6. 3、 2. 8、 6. 1、 5. 7。双氢葫芦素B灌胃给药制剂为乳剂。实施例7:
临床患者使用实例口服给药
女，41岁，卵巢癌
2006年进行切除手术，之后化疗4次；2007年七月手术切除，使用常规化疗抗癌药5月，病情均无改善(血清CA125为180u/ml,未降低)。2007年11月末开始服葫芦素软胶囊(制备方法葫芦素BE lg(含有葫芦素B0. 66g),中链甘油三酯(MCT) lOOOg，维生素E 100g,将MCT与维生素E混合均匀，加入处方量的葫芦素，6(TC加热溶解即得澄清透明的溶液。按照常规方法制备软胶囊。工艺详见CN 200710011513.2 ),每次一粒(含总葫芦素O. 3mg)，每日2次。IO曰后，患者饭量明显增加，精神状态显著改善；每十天检查一次CA125 ( CA125为分子量在200 ~ 1000KD的大分子糖蛋白)，平均每次均下降约4个指标数值，服药15天后，CA125由服药前的180 u/ml下降到120u/ml )。
另外尚有5位患者(年龄分别为46、 51、 57、 62、 53岁)在进行放射、化学治疗后口服葫芦素BE 口服乳剂(釆用巿售原料精制后制备乳剂，0. 2mg(总葫芦素，其中葫芦素BO. 12mg) /2ml/支。配制方法、工艺详见CN200710011513 2)， 每次一支，每日2次
结果表明'，4者服用i i后其食欲/体重/睡眠等生命指征均有明显改
善，肿瘤得到控制，CA125明显下降。特别是白细胞数，未联合治疗者，放射、化学治疗结束后，患者的白细胞"103)均小于4.0，而联合使用本品7天后，白细胞(xl()3)提高至大于6. 5,具有非常明显的升白作用。实施例8
阴道联合口服给药女，36岁，卵巢癌
2007年3月，诊断为卵巢癌，进行手术切除卵巢，由于化疗药反应严重而改服用本品。方法口服葫芦素BE乳剂(釆用巿售原料精制后制备乳剂，0.2mg(总葫芦素，其中葫芦素BO. 12mg) /2ml/支。配制方法、工艺详见CN 200710011513.2 ),每次一支，每日2次；同时结合阴道给药葫芦素软胶囊(制备方法CN 200710011513.2 )，每晚一粒(含总葫芦素0. 3mg(其中葫芦素BO. 18mg)),每日l次。7日后，精神状态明显改善，饭量与体重明显增加；CA125下降，服药90天后，CA125由术后的170 u/ml下降到22u/ml，属于正常数值。
9
权利要求
1、葫芦素新的医药用途，其特征在于葫芦素在制备治疗卵巢癌的药物及在降低卵巢癌患者血清CA125的药物中的应用。
2、 根据权利要求l所述的葫芦素新的医药用途，其特征在于所述的 葫芦素为葫芦科植物、十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数木科 植物及一些大型真菌中提取的一类四环三萜化合物、葫芦素粗提物一瓜蒂素。
3、 根据权利要求l所述的葫芦素新的医药用途，其特征在于所述的 葫芦素为葫芦素B、葫芦素B类物质及葫芦素BE、葫芦素I、葫芦素Q其 中的一种或者多种成分；作为组合物时，葫芦素B含量大于30y。；也可以 是葫芦素B单体、异葫芦素B单体、双氢葫芦素B单体、葫芦素I单体、 葫芦素Q单体。
4、 根据权利要求l所述的葫芦素新的医药用途，其特征在于可以单 独给药或者联合治疗。
5、 根据权利要求l所述的葫,素新的医药用途，其特征在于葫芦素 或其药用组合物可以与药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、 散剂、贴剂、软膏剂、气雾剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、注射剂，也可 以制成脂质体、微球、纳米粒、乳剂，用于腔道给药、外用、口服、注射。
6、 根据权利要求1或4所述的葫芦素新的医药用途，其特征在于所 述葫芦素给药剂量按照总葫芦素计算，健康成人用剂量为0. lmg 5mg/曰。
7、 根据权利要求6所述的葫芦素新的医药用途，其特征在于所述葫 芦素给药剂量为健康成人用剂量为0. 3mg 3mg/日，分1次~4次给药。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了葫芦素(Cucurbitacins)的新用途。即葫芦素B、葫芦素B类物质与葫芦素BE及其药学组合物在治疗卵巢癌、提高放射治疗患者的白血球数量药物中的新用途。也可以是葫芦素B单体、异葫芦素B单体、双氢葫芦素B单体、葫芦素I单体、葫芦素O单体。葫芦素或其药用组合物可以与药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、贴剂、软膏剂、气雾剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、注射剂，也可以制成脂质体、微球、纳米粒、乳剂等特殊剂型，用于腔道给药、外用、口服、注射。可以单独给药或者联合治疗，葫芦素给药剂量按照总葫芦素计算，健康成人用剂量为0.1mg～5mg/日，最佳剂量为0.3mg-3mg/日，分1次-4次给药。
文档编号A61K31/575GK101485665SQ20081019011
公开日2009年7月22日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年1月16日
发明者张美侠, 邓意辉 申请人:沈阳药科大学