专利名称：葫芦素的医药新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及葫芦素的医药新用途，具体地说是葫芦 素在人白血病的治疗中的应用，即葫声素有效单体成分单独或混合物在白 血病治疗中的用途。
背景技术：
白血病是一种造血组织的恶性疾病，俗称"血癌，，，特点是某一类型的 白血病细胞在骨髓或其他造血组织中的肿瘤性增生，可浸润体内各器官、 组织、使各个脏器的功能受损，产生相应的症状和体征。我国白血病患者 约为3~4人/10万人口，小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高，据调 查，我国<10岁小儿白血病的发病率为2.28/10万，任何年龄均可发病， 男性的发病率高于女性。临床对白血病主要的治疗手段主要是化学治疗， 但由于毒性大，易出现耐药性等问题，因而开发新的抗白血病化疗药物对 于白血病的治疗具有重要意义，目前从天然产物中发现新的抗白血病药物 受到广泛关注。
'葫芦素(Cucurbitacins)属于19-甲基出现在C-9位上的一类四环三 萜化合物，主要分布于葫声科植物中，为一类已知结构的天然产物，巿上 有售。国内70年代初从中药甜瓜蒂中分离出了葫芦素系列化合物，包括葫 芦素A-Q等，其中葫芦素B、 E为主要的活性成分，分布应用最广。国内葫 芦素片临床应用于肝癌和肝炎的治疗，国外有文献报道葫芦素体内可抑制 大鼠walkers 256肉瘤、艾氏腹水癌的发生。葫芦素对肿瘤细胞具有细胞 毒作用，可通过选择性地抑制A549、 MDA-MB-435和v-Src/NIH 3T3肿瘤 细胞JAK/STAT3信号途径促进肿瘤细胞的凋亡。但是葫声素抗白血病作用 及机制的研究国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供葫芦素有效单体成分单独或混合应用在白血病治 疗中的用途。
葫芦素有效单体包括葫芦素B、 E及有相似结构的葫芦素系列化合物。 所述白血病为急性白血病和慢性白血病 本发明的目的是通过以下技术方案实现的
葫芦素B分子结构
葫芦素E分子结构1、 体外抗肿瘤实验
葫芦素B、 E对体外培养的实体瘤细胞，包括HeLa (人宫颈癌细胞)， BEL7402 (人肝癌细胞)，SGC7901 (人胃癌细胞)和HT1080 (人成纤维瘤细 胞)；以及白血病细胞K562、 HL60均有不同程度的剂量依赖性抑制作用， 且对白血病细胞比实体瘤细胞更敏感.
2、 葫芦素B、 E可延长小鼠P388白血病模型动物的存活期。
3、 葫芦素影响人白血病K562、 HL60细胞周期。
葫芦素E (10、 30、 50 nM)作用于白血病细胞12小时，可使细胞周 期明显阻滞于G2/M期，G2/M阻滞与上调周期抑制蛋白p21及下调CDKl蛋 白从而抑制cyclin/CDK复合物活性有关。葫声素在此浓渡范围内无细胞毒 作用。
4、 高剂量葫芦素可诱导白血病HL60细胞凋亡，机制为上调死亡受体-5 (death receptor 5)，激活外源性细胞凋亡途径从而诱导细胞凋亡。
葫芦素有效单体单独或混合制备成注射液、粉针类非肠道或口服制剂 形式用于白血病的治疗。
本发明为应用葫芦素(Cucurbitacins)有效单体单独或混合治疗白血
病。葫芦素有效单体体内、体外抑制白血病细胞生长具有效果明显、毒性 低、'可长期连续给药、可与化疗及放疗合用的特点。
本发明的创新点之一在于首次发现在极低浓度(体外nM剂量级别)下， 葫芦素可抑制白血病细胞的增殖，葫芦素抑制白细胞增殖是通过下调CDK1 同时上调p21蛋白表达而使白血病细胞周期阻滞于G2/M期而实现的。首次 发现高剂量葫芦素可诱导白血病HL60细胞凋亡，机制为上调死亡受体5 (death receptor 5)，激活外源性细胞凋亡途径从而诱导细胞凋亡。葫, 素可延长小鼠P388白血病模型动物的存活期。以上实验结果证明葫芦素有 效单体单独或混合可制备成治疗人白血病的药物。
图1为实施例1中葫芦素对不同人癌细胞增殖抑制作用 图2为实施例3中葫芦素E对人白血病K562、 HL60细胞周期的影响 图3为实施例3中葫芦素E对人白血病K562、HL60细胞周期调控蛋白
'的影响
图4为实施例4中高剂量葫芦素E诱导人白血病HL60细胞凋亡作用 A为流式细胞仪检测细胞凋亡 B为DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 C为A0/EB荧光染色检测细胞凋亡 图5为实施例4中高剂量葫芦素E对人白血病HL60细胞凋亡作用信号 转导途径。
具体实施例方式
以下通过实施例，进一步对本发明进行描述。
实施例l葫芦素E、 B体外对人实体瘤和白血病细胞增殖抑制作用实验 1实验方法HeLa(人宫颈癌细胞)，BEL7402 (人肝癌细胞)，SGC7901 (人胃癌细胞) 和HT1080 (人成纤维瘤细胞)以每孔lxl()4个密度接种于24孔板中，在 含10%胎牛血清、2。/。谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中，37°C, 5% C(U香 养，24h后于不同板中分别加入不同浓度的葫芦素E、 B,另设阴性对照组 (加入含等量包含或不包含DMSO的培养液)。细胞分别于加药后72h消化 后用Trypan blue染色法计数细胞。
白血病细胞K562、 HL60以每孔2xl()4个/ml密度接种于24孔板中， 然后分别加入不同浓度的药液，另设阴性对照组(加入含等量包含或不包 含DMSO的培养液)，在含10%胎牛血清、2。/。谷氨酰胺的RPMI 1640培养 液中，37°C， 5% C02培养。72 h后用Trypan blue染色法计数细胞。 2试验结果
由图l可见，葫芦素B、 E对体外培养的实体瘤细胞，包括HeLa (人 宫颈癌细胞)，BEL7402 (人肝癌细胞)，SGC7901 (人胃癌细胞)和HT1080 (人 成纤维瘤细胞)以及人白血病细胞K562、 HL60均有不同程度的剂量依赖性 抑制作用。且体外对白血病细胞的作用比实体瘤细胞更敏感。 实施例2葫芦素B、 E体内对小鼠P388白血病模型动物存活期的影响 1实验方法
取DAB/2小鼠分成5组，分别为对照组(给予0. 5% CMC-Na )、葫芦素 E低剂量组、葫芦素E高剂量组、葫芦素B低剂量组、葫芦素B高剂量组。 各组动物分别于腹腔接种P388白血病细胞2xl()6个/只动物，于接种后24 小时每日分别腹腔注射相应剂量药物，给药容积为0. lml/kg,连续给药7 天，完毕，正常伺养动物，纪录各组动物的存活时间并计算生命延长率。 生命延长率(％)=[(给药组动物平均存活时间-对照组动物平均存活时间) /对照组动物平均存活时间]x100 2实验结果
—.由表l可见，葫芦素B、 E可明显提高P388小鼠白血病模型动物存活 时间。高剂量组动物生命延长率超过100%。
表l葫芦素B、 E对小鼠P388白血病模型动物存活期的影响
组别剂量动物数平均存活吋间生命延长率
(只)(天)(%)
对照组一1512.413.9—
葫芦素E低剂量组0.031021.5±5.473—4
葫芦素E高剂量组0.11026.113.4110.5
葫芦素B低剂量组0.031019.6±5.158.1
葫芦素B高剂量组0.11024.9±3.2皿8
实施例3流式细胞仪检测葫,素E对人白血病K562、 HL60细胞周期和周
期调控蛋白的影响
1实验方法1.1流式细胞仪检测葫声素E对人白血病K562、 HL60细胞周期的影响
HL60和K562细胞以1 x 1(^个/ml的密度种在培养瓶中，加药后12小 时，收集细胞，1000 rpm/分离心5分钟，小心弃尽上清，分别加入500 n 1PBS,混悬细胞，逐油加入10ml 70%的冰冷乙醇，-20。C固定过夜。检测 前样品2000 rpm/分，离心5分钟，小心弃尽上清，每份样品中加入IO ja l的RNAase(200 u g/ml )，混勾，37。C作用30分钟后,加入50 ja 1的PI (lmg/ml), 4。C避光作用30分钟，流式细胞仪检测，每个样品计数10000 个细胞。
1.2 western blotting检测细胞周期调控蛋白的影响
收集经药物处理细胞1 x 106个，1000 rpm/分，离心5分钟，弃上清， 加lml的PBS洗涤，转入Ependof f管中，1000 rpm/分离心5分钟，吸净 上清，加入蛋白裂解液冰洛裂解30分钟后，14000 rpm, 4。C离心15分钟， 冰洛中将上清液迅速移至另一Ependoff管中，用Bradford法测定样品蛋 白浓度。
分别配制所需浓度的分离胶和积层胶，按20-50 yg/孔上样，电泳后 将蛋白转移至PVDF膜。转印后的PVDF膜浸于含5%脱脂奶粉的封闭液中， 室温轻摇l h封闭，TBST洗膜三次，每次10分钟。加入一抗，4 。C孵育 过夜。 一抗杂交后的膜在TBST溶液中漂洗3次，每次室温轻摇10分钟。 加入二抗，室温轻摇孵育l小时。清洗后ECL发光底物显色，暗室中放入 医用X射线胶片曝光。 2实验结果
2.1.葫芦素对人白血病K562、 HL60细胞周期的影响
由图2可见，葫芦素E(IO、 30、 50 nM)作用于白血病细胞12小时， 可使细胞周期明现阻滞于G2/M期。葫芦素E在此浓渡范围内无凋亡诱导作 用。
2.2葫芦素对人白血病K562、 HL60细胞周期调控蛋白的影响
由图3可见，葫芦素E(IO、 30、 50 nM)作用于白血病细胞12小时， 可明显下调CDK1的表达，上调p21的表达，对cyclin A和cyclin Bl的 表达无影响。提示G2/M阻滞作用与上调p21和降低cyclin/CDK复合物活 性有关。
实施例4高剂量葫芦素E诱导人白血病HL60细胞凋亡作用及信号转导途 径。
1实验方法-
i. i.流式细k仪检测细胞凋亡
HL60和K562细胞以1 x 106+/ml的密度种在培养瓶中，加药后12小 时，收集细胞，1000 rpm/分离心5分钟，小心弃尽上清，分别加入500 y 1PBS，混悬细胞，逐^加入10ml 70°/。的冰冷乙醇，-20。C固定过夜。检测 前样品2000 rpm/分，离心5分钟，小心弃尽上清，每份样品中加入IO ja l的RNAase(200 ju g/ml ),混匀，37。C作用30分钟后，加入50 ja 1的PI (l鹏/ml), 4。C避光作用30分钟，流式细胞仪检测，每个样品计数10000个细胞。
1.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
收集药物处理细胞1 x 106个，加入细胞裂解液IOO ju 1 (Tris-HCl 10 mmol/L pH 7.4, EDTA 10 mmol/L pH 8.0 Triton X-100 0.5%) , 4。C放置 10 min, 14000 rpm离心5 min，取上清加2 ju 1 RNase A (20 g/L), 37 。C孵育60分钟，加入2 ja 1 proteinase K (20 g/L) 37。C脬育60分钟后， 加入NaCl (0. 5 mol/L)及50%异丙醇，-20。C放置过夜。14000 rpm离心15 min，尽量去除异丙醇，加入TE溶解液(Tris-HCl 10mmol/LpH7. 4， EDTA 1 mmol/L pH 8.0)溶解DNA, 100 V， 2%的琼脂糖凝胶电泳至溴酚蓝前 沿迁移至胶的2/3处，紫外透射仪下观察，并拍照。
1. 3 A0/EB双染荧光显微镜下计数细胞凋亡百分率
将HL60细胞按照lxl07ml密度培养于12孔板，加药，作用一定时间 后收集细胞于Ependoff管中，2000rpm离心3分钟，小心吸去上清液；每 Ependoff管中加入30jul的PBS,重悬细胞，再加入3 pl A0/EB染色液， 取20 fil染色后的细胞悬液点加到载玻片上，盖玻片轻盖后，荧光显微镜 下分别计数细胞总数和凋亡细胞数，计算凋亡百分率。 1.4 wester blotting检测凋亡调控蛋白
收集经药物处理细胞lxl()6个，蛋白裂解液冰浴裂f 30分钟后，收 集样品，上样前用Bradford法测定样品蛋白浓度。按20_5G jag/孔上样， 70V电泳后将蛋白转移至PVDF膜。 一抗杂交后的膜在TBST溶液中漂洗3 次，每次室温轻摇10分钟。加入二抗，室温轻摇孵育1小时后ECL发光 底物显色，暗室中放入医用X射线胶片曝光。 2实验结果
2.1高剂量葫芦素E诱导人白血病HL60细胞凋亡作用
流式细胞仪检测、DNA琼脂糖凝胶电泳及AO/EB荧光双染是细胞凋亡 常用的检测方法。由图4可见，高剂量葫芦素E作用于HL60细胞后可明显 诱导细胞凋亡，但对K562细胞无凋亡诱导作用。
2. 2高剂量葫芦素E诱导人白血病HL60细胞凋亡作用信号转导途径
由图5可见，在HL60细胞，葫芦素可明显激活PARP、 caspase-3、 caspase-8、 caspase-9及caspase-8的底物Bid蛋白；也可明显上调死亡 受喊-5 (death receptor 5， DR5 ),对调死亡受体-4 (death receptor 4, DR4)无明显影响。在K562细胞，葫芦素对死亡受体-4/5均无明显影响。 根据以上结果，葫芦素诱导HL60细胞凋亡是通过特异地上调死亡受体-5, 从而激活外源性凋亡途径最终诱导HL60细胞凋亡。
权利要求
1. 葫芦素的医药新用途，其特征在于葫芦素有效单体或其类似结构化合物单独或混合可用于制备治疗白血病的药物。
2. 根据权利要求l所述的葫芦素的医药新用途，其特征在于葫, 素有效单体包括葫芦素B、 E及有相似结构的葫芦素系列化合物。
3. 根据权利要求l所述的葫芦素的医药新用途，其特征在于所述 白血病为急性白血病和慢性白血病。
4. 根据权利要求l所述的葫芦素的医药新用途，葫芦素有效单体单 独或混合制备成注射液、粉针类非肠道或口服制剂形式用于白血病的治 疗。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了葫芦素(Cucurbitacins)的医药新用途，即葫芦素有效单体单独或混合在制备治疗白血病药物中的应用。纳摩尔浓度的葫芦素可明显抑制人白血病HL60和K562细胞的增殖，葫芦素在增殖抑制浓度范围内对人白血病细胞无细胞毒作用，且体外对白血病细胞的增殖抑制作用强于实体瘤细胞。进一步研究表明，提高葫芦素浓度，微摩尔浓度的葫芦素可诱导人白血病HL60细胞凋亡。体内抗肿瘤研究表明，葫芦素可延长小鼠P388白血病模型动物的存活时间。葫芦素有效单体抗白血病作用具有效果明显、毒性低、可长期连续给药、可与化疗及放疗合用的特点，有希望进一步开发为治疗白血病的药物。
文档编号A61K31/575GK101455672SQ200710158890
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者李艳春, 马恩龙 申请人:沈阳药科大学