一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明提供一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法及装置，涉及大豆细胞质雄性不育保持系的测定、恢复系及恢复能力的测定，利用这种方法选育不育系及恢复系，利用可被恢复系恢复但恢复程度不同的三类不育系作测交母本，以待测材料作父本，在大田分组穴播测交母本及待测父本，在测验材料开花前3-5天，每个测交小区用单独一个可拆卸的测交用网室罩上，在测交父、母本盛花期每个测交用网室内投放一定数量的苜蓿切叶蜂或人工驯化的蜜蜂为大豆传粉，花期结束后移去测交用网室，成熟后按组合收获F1杂交荚。下一种植季节鉴定F1植株花粉败育率，确定恢保关系，若是恢复系确定其恢复类型。本发明适于对大量种质进行大规模测定，用昆虫传粉替代人工杂交，省时、省工、高效。用不同类型不育系做测交母本，一次测交可测出待测材料是保持系还是恢复系以及恢复类型。
【专利说明】一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法及装置
[0001]【技术领域】:
发明提供一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法及装置，涉及大豆细胞质雄性不育保持系的测定、恢复系及恢复能力的测定，利用这种方法选育不育系及恢复系，属于作物杂交种选育【技术领域】。
[0002]【背景技术】:
“三系”杂交种是由不育系与恢复系杂交获得的F1种子。“三系”包含不育系、保持系和恢复系，不育系本身雄性不育雌性可育，只能接受外来的花粉才能结实；保持系具有保持不育系不育的特性，给不育系授粉，可以继续获得不育系；恢复系具有使不育系恢复正常可育的特性，给不育系授粉后所结种子在下一代种植时育性恢复正常，即为杂交种。在杂交种的选育中，不育系和恢复系是基础材料。因此任一种质资源首先需要确定其恢保关系，如果是保持系经过多代回交可转育为不育系，如果是恢复系，根据其恢复程度、配合力等特性可在育种中直接利用或作为育种中间材料间接利用。目前常用的测交方法主要是利用单一不育系作为测交母本，待测材料作为父本人工授粉杂交得到F1杂交荚，并在下一种植季种植F1种子，鉴定F1植株的花粉败育率确定其恢保关系。
[0003]常规的测交方法的存在以下缺点:一是人工杂交成活率不高、效率低，不适合大规模测交，特别是育种中对大量改良后代群体测交可操作性差；二是有相当多的不育系，可被某些不育系恢复，但不能被另一些恢复系恢复，即使可被某些不育系恢复，但反映不出恢复系的恢复能力。利用单一母本测交，容易漏掉只能恢复某些特定类型不育系的恢复系，同时无法确定其准确的恢复能力和程度。因此，常规测交方法不能完全满足大批量种质测交需要。
[0004]
【发明内容】
:
本发明提供一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，解决现有测交方法的诸多缺点，具有省时、省工、方法简单、操作方便、结果可靠、效率高等优点。
[0005]本发明还提供了适用于上述方法的装置。
[0006]本发明提供的一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，其特征在于:
同时利用一组典型的、不同类型的不育系为测交母本，在隔离条件下，采用一父多母的
配置方法，利用昆虫传粉，一次测交可测出待测材料是保持系还是恢复系以及不同的恢复类型。
[0007]本发明公开的一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，包括以下步骤:1)选择测交母本不育系:
第一测交母本，可被所有保持系保持，同时该类不育系可被所有恢复系恢复，F1花粉败育率在0-10%之间，属于极易被恢复类型，以JLCMS82A和JLCMS101A为代表，还包括在被恢复程度上与其类似的其他不育系；
第二测交母本，可被所有保持系保持，同时可被超过50%的恢复系恢复，F1花粉败育率在11-60%之间，属于易被恢复类型，以几CMS9A为代表，还包括在被恢复程度上与其类似的其他不育系。这类不育系可被超过50%的恢复系恢复；第三测交母本，可被所有保持系保持，同时仅能被小于10%的恢复系恢复，F1花粉败育率大于61%，属于难被恢复类型，以JLCMS89A和JLCMS31A为代表，还包括在被恢复程度上与其类似的其他不育系；
2)测交用网室:
测交用网室是由钢筋方框骨架及覆盖其上的纱网罩构成封闭空间，测交用网室的侧面纱网罩设有拉链开口；
3)田间播种方式:
播种季节，在大田按小区播种，步骤I)的三种测交母本与I个待测父本构成一个测交小区，每个小区播种1-2穴待测父本及4-5穴三种测交母本；小区大小为垂直垄向长80-130cm，平行垄向宽80-120cm ;播种方式为穴播，第一垄播种顺序为第一测交母本、待测父本和第三测交母本，第二垄播种顺序为第二测交母本、待测父本和第三测交母本，播种量为每穴4粒，出苗后定苗2株；根据父、母本的开花期适当调整父、母本的播种时间，以确保父、母本开花期一致；测交恢复系的恢复能力时，可同时选1-2个配合力高的不育系播种在小区内与恢复系杂交配制少量杂交种子；
此种植方式仅代表在一个测交用网室内分穴播种一份父本材料及多份母本材料，实际田间操作的播种顺序及穴距在满足材料能正常生长条件下可适当调整；“垄”在平播区也代表“行”；
4)架设测交用网室:
在测交父、母本开花前3-5天给每个测交小区上架设一个步骤2)的测交用网室，并除去网室内野生昆虫；
5)测交母本花粉败育率检查:
扣网前，给各个测交父、母本挂牌标记，扣网后，用显微镜镜检测交母本不育系花粉育性，拔除花粉败育率低于98%的植株；
6)传粉昆虫投放:
在测交父、母本盛花期，每个测交用网室投放2-3头苜蓿切叶蜂给测交母本传粉，为保证传粉质量，遇阴雨天气可重复投放一次苜蓿切叶蜂；若用蜜蜂传粉，采用微型小箱蜜蜂群体，蜂群大小100只左右；
7)传粉昆虫管理:
苜蓿切叶锋投放后不需要额外人工管理，蜜蜂需要定期饲喂糖浆，供饮清水；
8)杂交荚收获:
测交母本植株上杂交荚成熟后，按组合及编号收获杂交荚并详细记录种子来源；
9)杂交F1植株花粉败育率检查:下一个种植季,按组合种植杂交F1种子，通过观察F1植株花粉败育率，确定待测父本材料的恢保关系，若是恢复系，确定恢复系的类型。
[0008]本发明所述的高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，其特征在于步骤3)涉及的田间种植方式为:
播种季节，田间按小区播种，三种测交母本与I个待测父本构成一个测交小区，每个小区播种 1-2穴待测父本及4-5穴三种测交母本；小区大小为垂直垄向长80-130cm，平行垄向宽80-120cm ;播种方式为穴播，第一垄播种顺序为第一测交母本、待测父本和第三测交母本，第二垄播种顺序为第二测交母本、待测父本和第三测交母本，播种量为每穴4粒，出苗后定苗2株；根据父、母本的开花期适当调整父、母本的播种时间，以确保父、母本开花期一致；测交恢复系的恢复能力时，可同时选1-2个配合力高的不育系播种在小区内与其待测恢复系杂交配制少量杂交种子。
[0009]此种植方式仅代表在一个测交用网室分穴播种一份父本材料及多份母本材料，在田间实际操作中，播种顺序及穴距根据环境条件及植株性状可适当调整。
[0010]本发明与常规测交方法相比具有显著效果如下:
(1)测交信息详实，通过一次测交，可得到待测材料全面、准确的相关遗传信息。
[0011](2)授粉效率高，用切叶蜂或蜜蜂传粉，高异交率不育系最高可收获150粒以上杂交种子，低异交率不育系也可收获20粒以上杂交种子。
[0012](3)操作方法简单，无需额外的田间管理措施，可直接在田间垄上进行，开花前及花期结束后的田间管理与生产田相同。
[0013](4)适用于田间大规模测交，本技术解决了很难用人工杂交方式对大量种质进行测交并获得足够杂交荚的技术问题，特别是大量种质或杂交后代群体的测交。
[0014]【专利附图】
【附图说明】:
图1为本发明测交用网室结构示意图；
其中，1、骨架；2、罩网；3 、拉链开口 ；
图2为本发明田间测交小区播种示意图；
其中，早IA:第一测交母本不育系JLCMS82A或JLCMS101A ；早2A:第二测交母本不育系JLCMS9A ；早3A:第三测交母本不育系JLCMS89A或JLCMS31A ； ^:任一待检测父本大豆种质；
图3为本发明开花前田间测交用网室安装示意图。
【具体实施方式】:
实施例1:
1.选择测交亲本:
选择三种类型的不育系作为测交母本:(I)极易被恢复不育系JLCMS82A ；(2)易被恢复的不育系:JLCMS9A ；(3)难被恢复的不育系JLCMS89A。
[0015]选择任一待测种质作为待测父本。
[0016]2.准备测交用网室:
用直径为IOmm的钢筋焊接测交用网室:为简易组装可拆卸结构，骨架I的长、宽、高分别为80-130cmX80-120cmX130-160cm，定制纱网:纱网罩2规格为20目，骨架I上纱网罩2大小及形状与骨架I相匹配，以便于安装，纱网罩2侧面有高100-150cm的拉链开口 3，详见图1。
[0017]3.田间播种:
播种季节，按小区在田间播种，三个测交母本与I个待测父本构成一个测交小区，每个小区播种1-2穴待测父本及4-5穴三种测交母本；小区大小为垂直垄向长80-130cm，平行垄向宽80-120cm ;播种方式为穴播，第一垄播种顺序为JLCMS82A、待测父本和JLCMS89A，第二垄播种顺序为JLCMS9A、待测父本和JLCMS89A，播种量为每穴4粒，出苗后定苗2株；根据父、母本的开花期适当调整父、母本的播种时间，以确保父、母本开花期一致。
[0018]4.架设测交用网室:在测交父、母本开花前3-5天给每个测交小区上架设一个步骤2)的测交用网室，详见图3，用广谱低残留杀虫剂除去网室内所有昆虫。
[0019]5.检查测交母本花粉败育率:
扣网前，对各个测交小区的父、母本挂牌标记；扣网后，在测交母本开花初期，用显微镜检查其花粉败育率，拔出花粉败育率低于98%的植株，如测交母本纯度高，也可手检不育系花粉。
[0020]6.投放苜蓿切叶蜂:
在测交父、母盛花期的晴朗天气，每个网室投放2-3头苜蓿切叶蜂给测交母本传粉，为保证传粉质量，遇阴雨天气可重复投放一次苜蓿切叶蜂。
[0021]7.管理苜蓿切叶蜂:
投放苜蓿切叶蜂后，试验区及其周边50米内禁止使用对蜂类有毒性的农药，直至传粉结束，苜蓿切叶锋投放后不需要额外人工管理。
[0022]8.收获杂交荚:
当测交母本植株上杂交荚成熟时，按编号收获杂交荚并详细记录杂交种子来源。
[0023]9.杂交F1植株花粉败育率检查:
下一个种植季，在田间按组合播种杂交F1种子，开花期取样并用显微镜观察F1植株花粉败育率，确定待测材料的恢保关系，如果是保持系，继续回交数代可得到新的不育系；如果是恢复系，根据其对不同类型不育系的恢复表现，确定恢复系的类型。
`[0024]实施例2
1.测交亲本选择:
以三种类型的不育系作为测交母本:(I)极易被恢复不育系JLCMS101A ;(2)易被恢复的不育系JLCMS9A ；(3)难被恢复的不育系JLCMS31A。
[0025]选择任一待测种质作为待测父本。
[0026]2.准备测交专用网室:
用直径为IOmm的钢筋焊接测交用网室:为简易组装可拆卸结构，骨架I的长、宽、高分别为80-130cmX80-120cmX130-160cm，定制纱网:纱网罩2规格为20目，骨架I上纱网罩2大小及形状与骨架I相匹配，以便于安装，纱网罩网2侧面有高100-150cm的拉链开口 3，详见图1。
[0027]3.田间播种:
播种季节，按小区在田间播种，3个测交母本与I个待测父本构成一个测交小区，每个小区播种1-2穴待测父本及4-5穴三种测交母本；小区大小为垂直垄向长80-130cm，平行垄向宽80-120cm ;播种方式为穴播，第一垄播种顺序为JLCMS101A、待测父本和JLCMS31A，第二垄播种顺序为JLCMS9A、待测父本和JLCMS31A，播种量为每穴4粒，出苗后定苗2株；根据父、母本的开花期适当调整父、母本的播种时间，以确保父、母本开花期一致；
4.架设测交用网室:
在测交父、母本开花前3-5天给每个测交小区上架设一个步骤2)的测交用网室，详见图3，用广谱低残留杀虫剂除去网室内所有昆虫。
[0028]5.检查测交母本花粉败育率:
扣网前，对各个小区的测交父、母挂牌标记；扣网后，在测交母本开花初期，用显微镜检查其花粉败育率，拔出花粉败育率低于98%的植株，如测交母本纯度高，也可手检不育系花粉。
[0029]6.蜜蜂投放:
在测交父、母本盛花期的晴朗天气，每个网室投放I小箱蜜蜂传粉，蜂群大小100只左右。
[0030]7.蜜蜂管理:
投放蜜蜂后，试验区及其周边50米内禁止使用对蜜蜂有毒性的农药，直至传粉结束。蜜蜂需要定期饲喂糖浆，供饮清水。
[0031]8.杂交荚收获:
当测交母本植株上杂交荚成熟时，按编号收获杂交荚并详细记录杂交种子来源。
[0032]9.杂交F1植株花粉育性检查:
下一种植季节，在田间按组合播种杂交F1种子，开花期取样并用显微镜观察花粉败育率，确定待测材料的恢保关系，如果是保持系，继续回交数代可得到新的不育系；如果是恢复系，根据其对不同类型不育系的恢复表现，确定恢复系的类型。
[0033]实施例3
1.选择三种类型的不育系作为测交母本:
(O极易被恢复不育系:JLCMS82A ；(2`)易被恢复的不育系:JLCMS9A ；(3)难被恢复的不育系JLCMS31A。
[0034]选择任一待测种质作为待测父本。
[0035]2.准备测交专用网室:
用直径为IOmm的钢筋焊接测交用网室:为简易组装可拆卸结构，骨架I的长、宽、高分别为80-130cmX80-120cmX130-160cm，定制纱网:纱网罩2规格为20目，骨架I上纱网罩2大小及形状与骨架I相匹配，以便于安装，纱网罩2侧面有高100-150cm的拉链3，详见图1o
[0036]3.田间播种:
播种季节，按小区在田间播种，三种测交母本与I个待测父本构成一个测交小区，每个小区播种1-2穴待测父本及4-5穴三种测交母本；小区大小为垂直垄向长80-130cm，平行垄向宽80-120cm ;播种方式为穴播，第一垄播种顺序为JLCMS82A、待测父本和JLCMS31A，第二垄播种顺序为JLCMS9A、待测父本和JLCMS31A，播种量为每穴4粒，出苗后定苗2株；根据父、母本的开花期适当调整父、母本的播种时间，以确保父、母本开花期一致。
[0037]4.架设测交用网室:
在测交父、母本开花前3-5天给每个测交小区上架设一个步骤2)的测交用网室，详见图3，用广谱低残留杀虫剂除去网室内所有昆虫。
[0038]5.检查测交母本花粉败育率:
扣网前，对各个测交小区的父、母本挂牌标记；扣网后，在测交母本开花初期，用显微镜镜检其花粉败育率，拔出花粉败育率低于98%的植株，如测交母本纯度高，也可手检不育系花粉。
[0039]6.投放苜蓿切叶蜂:
在测交父、母本盛花期的晴朗天气，每个网室投放2-3头苜蓿切叶蜂给测交母本传粉，为保证传粉质量，遇阴雨天气可重复投放一次苜蓿切叶蜂。
[0040]7.管理苜蓿切叶蜂:
投放苜蓿切叶蜂后试验区及其周边50米内禁止使用对蜂类有毒性的农药，直至传粉结束，苜蓿切叶锋投放后不需要额外人工管理。
[0041]8.杂交荚收获:
当测交母本植株上杂交荚成熟时，按编号收获杂交荚并详细记录杂交种子来源。
[0042]9.杂交F1植株花粉育性检查:
下一年春季，在田间按组合播种杂交F1种子，开花期取样并用显微镜观察花粉败育率，确定待测材料的恢保关系，如果是保持系，继续回交数代可得到新的不育系；如果是恢复系，根据其对不同类型不育系的恢复表现，确定恢复系的类型。
[0043]通过以下试验表明本发明专利的积极效果:
试验例1:
验证实施例1测定大豆RN型不育细胞质保持系和恢复系的恢复类型。
[0044](I)任选3份大豆材料进行测交，分别为JLCMS8B、JLCMSR4和S37。
[0045](2)田间种植及开 花前田间管理，田间分3个小区播种，小区一播种顺序:第一垄分别为 JLCMS82A、JLCMS8B 和 JLCMS89A，平行第二垄分别为 JLCMS89A、JLCMS8B 和JLCMS9A,穴距40cm ;垂直垄向播种第二、三个小区，相邻两小区间隔I垄，父本分别为JLCMSR4和S37，测交父、母本种植方式同第一个小区；开花前田间管理方式同大豆生产田。
[0046](3)在开花前对所有测交父、母本挂牌标记，同时在测交小区上组装架设测交用网室，把所有测交父、母本罩在网室内。参照图3。
[0047](4)测交母本花粉败育率检查，在测交母本初花期选取即将开放的花蕾，每株取3朵花，用70%乙醇固定备用；在实验室内用I2-KI染色法观察花粉败育率，拔除花粉败育率低于98%的植株。
[0048](5)苜蓿切叶蜂投放、管理:在测交父、母本盛花期的晴朗天气，每个网室投放2-3头苜蓿切叶蜂给测交母本传粉。投放苜蓿切叶蜂后，试验区及其周边50米内禁止使用对苜蓿切叶蜂有毒性的农药，直至传粉结束。苜蓿切叶锋投放后不需要额外人工管理。
[0049](6)杂交荚收获:当测交母本植株上杂交荚成熟时，按组合及编号收获杂交荚，JLCMS8B作为侧交父本的小区一，在JLCMS82A、JLCMS9A和JLCMS89A上分别收获151粒、59粒和32粒杂交种子；JLCMSR4作为侧交父本的小区二，在JLCMS82A、JLCMS9A和JLCMS89A上分别收获种子128粒、47粒和22粒；S37作为侧交父本的小区三，在JLCMS82A、JLCMS9A和JLCMS89A上分别收获种子118粒、41粒和20粒。
[0050](7)第二年春季按组合种植三个小区的杂交F1种子，每个组合播种15粒种子，开花期对每个组合的10个单株即将开放的花蕾取样，用75%的酒精固定，实验室内用I2-KI染色法观察花粉败育率，将花粉平均败育率结果列于表1。
[0051 ] 表1 3份测交父本F1花粉败育率统计(％)
【权利要求】
1.一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，其特征在于: 同时利用一组典型的、不同类型的不育系为测交母本，在隔离条件下，采用一父多母的配置方法，利用昆虫传粉，一次测交可测出待测材料是保持系还是恢复系以及不同的恢复类型。
2.一种高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，包括以下步骤: 1)选择测交母本: 第一测交母本:该类不育系可被所有保持系保持，同时可被所有恢复系恢复，F1花粉败育率在0-10%之间； 第二测交母本:该类不育系可被所有保持系保持，同时可被超过50%的恢复系恢复，F1花粉败育率在11-60%之间； 第三测交母本:可被所有保持系保持，同时仅能被小于10%的恢复系恢复,F1花粉败育率大于61% ； 2)测交用网室: 测交用网室是由钢筋方框骨架及覆盖其上的纱网罩构成封闭空间，测交用网室的侧面纱网设有拉链开口； 3)田间播种方式: 播种季节，在大田按小区播种，步骤I)的三种测交母本与I个待测父本构成一个测交小区，每个小区播种1-2穴待测父本及4-5穴三种测交母本；小区大小为垂直垄向长80-130cm，平行垄向宽80-120cm ;播种方式为穴播，第一垄播种顺序为第一测交母本、待测父本和第三测交母本，第二垄播种顺序为第二测交母本、待测父本和第三测交母本，播种量为每穴4粒，出苗后定苗2株；根据父、母本的开花期适当调整父、母本的播种时间，以确保父、母本开花期一致；测交恢复系的恢复能力时，可同时选1-2个配合力高的不育系播种在小区内与其杂交配制少量杂交种子； 4)架设测交用网室: 在测交父、母本开花前3-5天给每个测交小区上架设一个步骤2)的测交用网室，并除去网室内野生昆虫； 5)不育系花粉败育率检查: 扣测交用网室前 ，给各个测交父、母本挂牌标记，扣测交用网室后，用显微镜检查测交母本不育系花粉败育率，拔除花粉败育率低于98%的植株； 6)传粉昆虫投放: 在测交父、母本盛花期，每个测交用网室投放2-3头苜蓿切叶蜂给测交母本传粉，为保证传粉质量，遇阴雨天气可重复投放一次苜蓿切叶蜂；或用蜜蜂传粉，蜂群大小100只左右； 7)传粉昆虫管理: 苜蓿切叶锋投放后不需要额外人工管理；蜜蜂需要定期饲喂糖浆，供饮清水； 8)杂交荚收获: 测交母本植株上杂交荚成熟后，按组合及编号收获杂交荚并详细记录种子来源； 9)杂交F1植株花粉败育率检查:在下一个种植季,按组合种植杂交F1种子，通过观察F1植株花粉败育率，确定待测父本材料的恢保关系，若是恢复系，确定恢复系的类型。
3.根据权利要求2所述的高效的大豆细胞质雄性不育的测交方法，其特征在于: 第一测交母本以JLCMS82A或JLCMS101A为代表的不育系；第二测交母本以JLCMS9A为代表的不育系；第三测 交母本以JLCMS89A或JLCMS31A为代表的不育系。
【文档编号】A01H1/02GK103828708SQ201410097321
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】张井勇, 赵丽梅, 孙寰, 彭宝, 张伟, 张春宝, 张伟龙, 闫昊, 李慧 申请人:吉林省农业科学院