微黄白链霉菌及其在植物病害防治中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物农药【技术领域】，具体公开了一种微黄白链霉菌及其在植物病害防治中的应用。该微黄白链霉菌（Streptomyces?albidoflavus）SY-FX-14，保藏日期为2013年12月25日，保藏编号为CGMCC?No.8613。本发明首次从牛粪土中分离得到微黄白链霉菌SY-FX-14，实验表明，微黄白链霉菌（Streptomyces?albidoflavus）SY-FX-14对白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黄瓜炭疽、棉花黄萎、黄瓜灰霉、水稻恶苗、番茄青枯、水稻纹枯、烟草黑胫、小麦根腐、水稻稻瘟、小麦赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黄瓜褐斑、黄瓜霜霉病原菌均具有明显的抑制生长作用，具有较好的应用前景。
【专利说明】微黄白链霉菌及其在植物病害防治中的应用
【【技术领域】】
[0001]本发明属于生物农药【技术领域】，特别涉及一种微黄白链霉菌及其在植物病害防治中的应用。
【【背景技术】】
[0002]微生物农药由于其绿色环保，不易产生抗药性的特性，在防治作物病虫害方面得到越来越广泛的重视和应用。微生物农药的推广和应用技术正逐渐趋于成熟，国家在生物防治领域的政策支持力度逐年加大，微生物农药的使用能克服化学农药对生态环境的污染并减少在 农副产品中农药的残留，提升农副产品的品质和价格，既具有环境效益又具有经济效益。
[0003]目前，市场上推广的主要微生物农药品种集中在芽孢杆菌属和假单胞菌属。链霉菌属是一类能产生抗生素的微生物菌属，作为农用杀真菌类在美国和欧洲登记的种为Streptomyces griseoviridis和Streptomyces Iydicus,链霉菌属有望成为继芽抱杆菌属和假单胞菌属后另一类在生物防治领域广泛应用的微生物农药。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明的首要目的在于提供一种微黄白链霉菌。
[0005]本发明的另一目的在于提供所述的微黄白链霉菌的制备方法。
[0006]本发明的再一目的在于提供所述的微黄白链霉菌的应用。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:微黄白链霉菌(Streptomycesalbidof lavus) SY-FX-14,保藏日期为2013年12月25日，保藏编号为CGMCC N0.8613 ;保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号(100101)。
[0008]所述的微黄白链霉菌SY-FX-14，分离自辽宁铁岭地区牛粪土，其具有以下生物学特性:(I)在保藏培养基生长，菌丝乳黄色，随着培养时间延长，菌丝颜色加深变灰；(2)在种子培养基生长，菌丝乳白色，菌落与培养基结合处出现茶色色素；(3)在发酵培养基生长菌丝浅灰色，后逐渐变为土黄色，在液体培养中后期呈较大的浅黄色菌丝团。
[0009]所述的微黄白链霉菌SY-FX-14采用以下方法进行培养:将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33°C活化12-24h后置于种子培养基中，于25-33°C、100-150r/min培养1-2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33°C、100-150r/min振荡培养2_4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14。
[0010]所述的保藏培养基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，水 1L, ρΗ7.4-7.6。
[0011]所述的种子培养基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g, K2HPO4Ig,水 1L。
[0012]所述的发酵培养基:玉米粉20g,鹿糖10g,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g,NaC12g,K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO3Ig,水 1L。
[0013]所述的振荡培养的时间优选为3天。
[0014]所述的微黄白链霉菌SY-FX-14可应用于防治植物病害；
[0015]所述的植物病害为白香瓜瓜腐(Choanephora cucurhtarum)、辣椒枯萎(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum (Atk.) Synder et Hansen)、番煎早疫(Alternariasolan1.)、黄瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、棉花黄萎(Verticillium dahliae)、黄瓜灰霉(bocrytis Cinerea Pers.)、水稻恶苗(Fusarium moniliforme Sheld.)、番煎青枯(Pseudomanas solanacearumSmith)、水稻纹枯(Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk)、烟草黑腔(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)、小麦根腐(Cochliobolussat1-vu (Ito et Kurib.) Drechsl.)、水稻稻痕(hyricularia grisea (Cooke) Sacc.)、小麦赤霉(Fusarium graminearum Schw.)、油菜菌核(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)de Bary)、大豆根腐(Fusarium orthoceras Appel.Et Wollenweber)、番煎灰霉(Botrytiscinerea)、黄瓜掲斑(Corynespora cassiicola)和黄瓜霜霉(Pseudoperonosporacubensis (Berk.Et Curt.) Rostov)中的至少一种。
[0016]一种微生物菌剂，由上述微黄白链霉菌SY-FX-14得到。
[0017]所述的微生物菌剂通过如下方法制备得到:将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33°C活化12-24h后置于种子培养基中，于25_33°C、100_150r/min培养1-2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33°C、100-150r/min振荡培养2-4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14 ;将得到的微黄白链霉菌SY-FX-14与基质混合，得到微生物菌剂。
[0018]所述的保藏培养基:可溶性淀粉20g，KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，水 1L，ρΗ7.4-7.6。
[0019]所述的种子培养基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 ILo
[0020]所述的发酵培养基:玉米粉20g，鹿糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaC12g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO3Ig,水 1L。
[0021]所述的基质为草炭土、膨润土或微粉碳酸钙。
[0022]所述的微生物菌剂具有广谱杀菌活性，可用于防治植物病害；
[0023]所述的植物病害为白香瓜瓜腐(Choanephora cucurhtarum)、辣椒枯萎(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum (Atk.) Synder et Hansen)、番煎早疫(Alternariasolan1.)、黄瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、棉花黄萎(Verticillium dahliae)、黄瓜灰霉(bocrytis Cinerea Pers.)、水稻恶苗(Fusarium moni liforme Sheld.)、番煎青枯(Pseudomanas solanacearumSmith)、水稻纹枯(Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk)、烟草黑腔(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)、小麦根腐(Cochliobolussat1-vu (Ito et Kurib.) Drechsl.)、水稻稻痕(hyricularia grisea (Cooke) Sacc.)、小麦赤霉(Fusarium graminearum Schw.)、油菜菌核(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)de Bary)、大豆根腐(Fusarium orthoceras Appel.Et Wollenweber)、番煎灰霉(Botrytiscinerea)、黄瓜掲斑(Corynespora cassiicola)和黄瓜霜霉(Pseudoperonosporacubensis (Berk.Et Curt.) Rostov)中的至少一种。[0024]本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果:
[0025]本发明首次从牛粪土中分离得到微黄白链霉菌SY-FX-14，实验结果表明，微黄白链霉菌(Streptomyces albidof lavus) SY-FX-14对白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番爺早疫、黄瓜炭疽、棉花黄萎、黄瓜灰霉、水稻恶苗、番茄青枯、水稻纹枯、烟草黑胫、小麦根腐、水稻稻瘟、小麦赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黄瓜褐斑、黄瓜霜霉病原菌均具有明显的抑制生长作用。室内生物活性测定结果表明该菌株能防治上述植物病害。而且该微生物菌剂制备工艺简单、发酵周期短、并能够快速在土壤和植物体定殖，具有较好的应用前景。
【【具体实施方式】】
[0026]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围并不限于此。
[0027]实施例1
[0028]微黄白链霉菌(Streptomycesalbidof lavus) SY-FX-14 的分离和鉴定:
[0029](I)微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14 的分离
[0030]从辽宁铁岭地区牛粪土采集土壤10g，加入内装IOOmL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于120r/min摇床上振荡30min，振荡结束后静置lh，取上清0.5mL加入4.5mL无菌水中，涡旋混合，依次稀释10_2、10_3、10_4倍，分别取150 μ L稀释液涂布于高氏一号培养基平板上，每个梯度涂布 3个平行，在28°C培养3d，挑取培养基上的单菌落进行平板划线纯化，获得微黄白链霉菌菌株。
[0031](2)微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14 的鉴定
[0032]16S rRNA基因序列测序结果表明SY-FX-14菌株的16S rRNA基因序列为序列表I中核苷酸序列。根据测序结果与Genbank中链霉菌16S rRNA基因序列进行同源性比较，结果表明SY-FX-14菌属于链霉菌属(Streptomyces)中的微黄白链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。
[0033]实施例2
[0034]微黄白链霉菌(Streptomycesalbidoflavus) SY-FX-14 的制备:
[0035](I)培养基的配制
[0036]保藏培养基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，FeSO4.7H200.01g, MgSO4.7H200.5g，水 1L，pH7.4-7.6 ；
[0037]种子培养基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL ；
[0038]发酵培养基:玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0039]将上述培养基于121 °C高压蒸汽灭菌20min，待用。
[0040](2)菌种活化
[0041]将微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14转接种子斜面培养基，置于恒温培养箱中，28 °C培养48h。
[0042](3)种子培养
[0043]选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装IOOmL培养基)中，于28°C、120r/min振荡培养48h。
[0044](4)发酵培养
[0045]将步骤(1)的发酵培养基置于发酵罐中，在121°C条件下灭菌20min，灭菌完成后待冷却至室温时接入4%预先活化好的种子菌液。此时控制发酵罐转速为120r/min，通气量为1:1-1:1.2，温度为28°C，培养72h，培养过程中自动添加0.05%有机硅油消泡剂。通过显微观察，平板计数检测发酵液中的有效活菌数为7*109cfu/g。
[0046]实施例3
[0047]微黄白链霉菌(Streptomycesalbidoflavus) SY-FX-14 的制备:
[0048](I)培养基的配制
[0049]保藏培养基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，FeSO4.7H200.01g, MgSO4.7H200.5g，水 1L，pH7.4-7.6 ；
[0050]种子培养基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL ；
[0051]发酵培养基:玉米粉20g,鹿糖IOg,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g, NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, C aCO3Ig,水 1L。
[0052]将上述培养基于121 °C高压蒸汽灭菌20min，待用。
[0053](2)菌种活化
[0054]将微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14转接种子斜面培养基，置于恒温培养箱中，25°C培养18h。
[0055](3)种子培养
[0056]选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装IOOmL培养基)中，于25°C、130r/min振荡培养48h。
[0057](4)发酵培养
[0058]将步骤(1)的发酵培养基置于发酵罐中，在121°C条件下灭菌20min，灭菌完成后待冷却至室温时接入6%预先活化好的种子菌液。此时控制发酵罐转速为130r/min，通气量为1:1-1:1.2，温度为25°C，培养96h，培养过程中自动添加0.05%有机硅油消泡剂。通过显微观察，平板计数检测发酵液中的有效活菌数为7*109cfu/g。
[0059]实施例4
[0060]微黄白链霉菌(Streptomycesalbidoflavus) SY-FX-14 的制备:
[0061](I)培养基的配制
[0062]保藏培养基:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，FeSO4.7H200.01g, MgSO4.7H200.5g，水 1L，pH7.4-7.6 ；
[0063]种子培养基:蔗糖30g，蛋白胨 5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL ；
[0064]发酵培养基:玉米粉20g,鹿糖10g,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g, NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
[0065]将上述培养基于121 °C高压蒸汽灭菌20min，待用。
[0066](2)菌种活化
[0067]将微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14转接种子斜面培养基，置于恒温培养箱中，33°C培养12h。
[0068](3)种子培养
[0069]选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装IOOmL培养基)中，于33°C、110r/min振荡培养36h。
[0070](4)发酵培养
[0071]将步骤(1)的发酵培养基置于发酵罐中，在121°C条件下灭菌20min，灭菌完成后待冷却至室温时接入8%预先活化好的种子菌液。此时控制发酵罐转速为llOr/min，通气量为1:1-1:1.2，温度为33°C，培养48h，培养过程中自动添加0.05%有机硅油消泡剂。通过显微观察，平板计数检测发酵液中的有效活菌数为7*109cfu/g。
[0072]实施例5
[0073]微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX-14对病原真菌的抑菌活性的检测:
[0074]采用平板对峙生长法,微黄白链霉菌(Streptomyces albidof lavus) SY-FX-14在发酵培养基培养好后，在平板直径两端距离平板边缘1.0-1.5cm处点接于PDA培养基上。供试真菌在PDA平板活化培养形成菌落，用打孔器(5_)制取菌饼，将菌丝面朝下接菌于PDA平板中央。将接种好的平板置于28°C生化培养箱中培养至微黄白链霉菌(Sti^ptomycesalbid0flavus)SY-FX-14与病原菌间形成明显的抑菌带。拮抗作用强弱以“ + ”，表示。“+++”:拮抗活性很强，抑菌带宽度大于8.0mm:拮抗活性中等强度，抑菌带宽度在3.0mm和
8.0mm之间；“ + ”:拮抗活性弱或无活性，抑菌带宽度小于3.0mm或者无抑菌带，病菌正常生长，而且可覆盖微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus) SY-FX-14?
[0075]微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX-14对供试病原真菌的抑制作用结果如表1所示。
[0076]从表1可以看出，微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX_14对辣椒枯萎、黄瓜炭疽、黄瓜灰霉、小麦赤霉、小麦根腐、油菜菌核、大豆根腐病原菌的抑制效果很强，为“+++”;对白香瓜瓜腐、番茄灰霉、番茄早疫、棉花黄萎、水稻恶苗、水稻纹枯、番茄青枯、烟草黑胫、水稻稻瘟、黄瓜褐斑、黄瓜霜霉病原菌的抑制效果较强，为“++”。
[0077]表1微黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)SY-FX-14对供试病原真菌的抑
制作用
[0078]
【权利要求】
1.微黄白链霉菌(Streptomycesalbidoflavus) SY-FX-14,保藏日期为 2013 年 12 月25日，保藏编号为CGMCCN0.8613。
2.权利要求1所述的微黄白链霉菌SY-FX-14的培养方法，其特征在于，所述的微黄白链霉菌SY-FX-14采用以下方法进行培养:将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33°C活化12-24h后置于种子培养基中，于25-33°C、100-150r/min培养1_2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33°C、100-150r/min振荡培养2_4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14。
3.根据权利要求2所述的微黄白链霉菌SY-FX-14的培养方法，其特征在于，所述的保藏培养基的成分如下:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, NaCl0.5g，K2HPO4.3Η200.5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，水 1L, ρΗ7.4-7.6。
4.根据权利要求2所述的微黄白链霉菌SY-FX-14的培养方法，其特征在于，所述的种子培养基的成分如下:蔗糖 30g，蛋白胨 5g，FeSO4.7Η200.01g, MgSO4.7Η200.5g，KC10.5g，K2HPO4Ig,水 IL0
5.根据权利要求2所述的微黄白链霉菌SY-FX-14的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基的成分如下:玉米粉20g,鹿糖IOg,蛋白胨2g,淀粉5g,酵母膏2g, NaC12g,K2HPO40.5g, MgSO40.5g, CaCO3Ig,水 1L。
6.权利要求1所述的微黄白链霉菌SY-FX-14应用于防治植物病害。
7.根据权利 要求6所述的微黄白链霉菌SY-FX-14的应用，其特征在于，所述的植物病害为白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黄瓜炭疽、棉花黄萎、黄瓜灰霉、水稻恶苗、番茄青枯、水稻纹枯、烟草黑胫、小麦根腐、水稻稻瘟、小麦赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黄瓜褐斑和黄瓜霜霉中的至少一种。
【文档编号】A01N63/02GK103992967SQ201410152770
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】胥维昌, 李秀颖, 戴速航, 孙慧, 王宇, 李旭 申请人:中国中化股份有限公司, 沈阳化工研究院有限公司