一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法。具体地讲，本发明是通过农杆菌介导，将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30中。在遗传转化过程中，本发明采用了特制的培养基以及比常规介导方法更好地转化方式。通过PCR检测鉴定，表明外源基因已导入8m30中。该方法成功实现了闭颖授粉的粳稻品种的遗传转化，在加快性状改良过程同时，可避免花粉外传导致的基因漂移。
【专利说明】一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30的遗传转化方法。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物，世界上60%以上的人口以稻米为主食。近年来面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响，人口增长和生态环境的压力，现代生物技术手段，特别是转基因技术在作物遗传改良方面的重要性日渐凸显。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。
[0003]但随着转基因作物的种植范围迅速扩大，转基因作物及其产品的安全性，引起了广泛关注。例如转基因品种花粉外传会带来基因漂移，可能产生“超级杂草”等风险，但目前缺乏实用有效的技术手段加以克服，比如物理隔离需要一定的空间阻止花粉传播(水稻需在IOOm以上)，只适于小面积实验，在大面积生产中是不切实际的。 [0004]而闭颖授粉品种在整个授粉过程中，颖花不张开，花药不外露，花粉不会向外传播，可以有效抑制花粉外传，避免基因污染。通过闭颖受体来解决基因污染问题，是目前被认为最可行的技术手段，但目前生产还缺乏实用化的闭颖水稻品种。本实验室创制的8m30等闭颖授粉粳稻品种，不仅完全闭颖授粉，而且结实率、株高等重要农艺性状较好，可作为理想的转基因受体应用于品种快速遗传改良，减少生态风险。
[0005]但目前还没有闭颖授粉水稻品种的遗传转化方法的报道。
【发明内容】
[0006]为充分利用具有闭颖授粉性状的独特遗传资源，本发明旨在建立一种适用于闭颖授粉粳稻品种的遗传转化方法。
[0007]本发明的目的是提供一种通过农杆菌介导，将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30的遗传转化方法，以及基于该方法来制备转基因水稻植株的方法。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。
[0008]具体而言，在一个方面，本发明提供一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法，包括下述步骤:
[0009]步骤1、将粳稻品种8m30的种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
[0010]步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；
[0011]步骤3、将步骤2中获得的愈伤组织与携带外源基因的农杆菌接触持续第一预定时间段；
[0012]步骤4、将步骤3所获得的愈伤组织转移到垫有无菌滤纸的培养皿中，21_23°C培养第二预定时间段，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基；[0013]步骤5、将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
[0014]步骤6、将步骤5处理后的愈伤组织转移到筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
[0015]步骤7、将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
[0016]步骤8、将步骤7所获得的苗转移到生根培养基中生根。
[0017]在一种优选实现方式中，所述组织诱导培养基中[N<V]/[NH4+] = 40mM/10mM ；
[0018]所述前筛选培养基中[NO3-] / [NH4+] = 40mM/10mM ;在所述分化再生培养基中[NO3I/[NH4+] = 40mM/10mM，并且含 1.5mg/L 萘乙酸(NAA)和 lmg/L6_ 苄氨基嘌呤(6-BA)；所述生根培养基中含0.4mg/L的萘乙酸。
[0019]在一种优选实现方式中，所述步骤I中的种子是成熟种子；和/或
[0020]所述步骤1、2中的诱导培养基包括:(优化的或预定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3g/L植物凝胶，该诱导培养基的pH为5.80 ；和/或
[0021]所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中，农杆菌中携带有外源基因；和/或
[0022]所述步骤4中的 农杆菌悬浮培养基包括:(优化的或预定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4-D、20g/L鹿糖、10g/L葡萄糖、100 μ mol/L乙酰丁香酮,该农杆菌悬浮培养基的pH为5.20 ;和/或
[0023]所述步骤5中的前筛选培养基包括所述愈伤组织诱导培养基以及250mg/L羧苄青霉素；和/或
[0024]所述步骤6中的筛选培养基包括所述愈伤组织诱导培养基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素；和/或
[0025]所述步骤7中的分化再生培养基包括大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、lg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、30g/L 山梨醇、500mg/L MES,2.5mg/L CuS04、l.5mg/L萘乙酸、lmg/L6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧节青霉素、2.5g/L植物凝胶,该分化再生培养基PH值为5.80 ;和/或
[0026]所述步骤8中的生根培养基包括1/2MS (Murashige&Skoog)基础盐2.165g/L、MS维生素、20g/L鹿糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧节青霉素、3.5g/L植物凝胶，该生根培养基pH值为5.80。
[0027]在一种优选实现方式中，所述大量元素中[N<V]/[NH4+] = 40mM/10mM,包括KN0340mM, (NH4) 2S045mM, MgSO4.7H200.75mM, ΚΗ2Ρ042.93mM CaCl2.2Η201.13mM。
[0028]在一种优选实现方式中，所述第一预定时间段为15分钟；所述第二预定时间段为48小时。
[0029]在一种优选实现方式中，所述步骤3包括选取分裂旺盛的愈伤组织收集至50mL的无菌离心管中与农杆菌接触。
[0030]另一方面，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括:
[0031]I)通过上述方法将预定外源基因导入水稻细胞；和
[0032]2)利用导入了所述外源基因的水稻细胞培育水稻植株。
[0033]在另一个方面，本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分:
[0034](I)愈伤组织诱导培养基；
[0035](2)农杆菌悬浮培养基；
[0036](3)前筛选培养基；
[0037](4)筛选培养基；
[0038](5)分化再生培养基；
[0039](6)生根培养基。
[0040]其中所述(1)-(6)分别包含如说明书表1所示的成分。
[0041]表1培养基的示例性配方
[0042]
【权利要求】
1.一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法，包括下述步骤: 步骤1、将粳稻品种8m30的种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织； 步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养； 步骤3、将步骤2中获得的愈伤组织与携带所述外源基因的农杆菌接触持续第一预定时间段； 步骤4、将步骤3所获得的愈伤组织转移到垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23°C培养第二预定时间段，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基； 步骤5、将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天； 步骤6、将步骤5处理后的愈伤组织转移到筛选培 养基上，以获得抗性愈伤组织； 步骤7、将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和 步骤8、将步骤7所获得的苗转移到生根培养基中生根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织诱导培养基中[Ν03-]/[ΝΗ4+]=40mM/10mM ； 所述前筛选培养基中[N03-]/[NH4+] = 40mM/10mM;在所述分化再生培养基中[N03_]/[NH4+] = 40mM/10mM，并且含L 5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_苄氨基嘌呤(6-BA);所述生根培养基中含0.4mg/L的萘乙酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤I中的种子是成熟种子；和/或 所述步骤1、2中的诱导培养基包括:大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L鹿糖、2mg/L2,4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3g/L植物凝胶，该诱导培养基的pH为5.80 ;和/或 所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中；和/或所述步骤4中的农杆菌悬浮培养基包括:大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4_D、20g/L鹿糖、10g/L葡萄糖、100 μ mol/L乙酰丁香酮,该农杆菌悬浮培养基的pH为5.20 ;和/或 所述步骤5中的前筛选培养基包括所述愈伤组织诱导培养基以及250mg/L羧苄青霉素；和/或 所述步骤6中的筛选培养基包括所述愈伤组织诱导培养基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素；和/或 所述步骤7中的分化再生培养基包括大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、Ig/L 酪蛋白酶水解物、30g/L 蔗糖、30g/L 山梨醇、500mg/L MES,2.5mg/L CuS04、l.5mg/L 萘乙酸、lmg/L6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶，该分化再生培养基PH值为5.80 ;和/或 所述步骤8中的生根培养基包括l/2MS(Murashige&Skoog)基础盐2.165g/L、MS维生素、20g/L鹿糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧节青霉素、3.5g/L植物凝胶,该生根培养基PH值为5.80。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大量元素中[Ν03-]/[ΝΗ4+]=40mM/10mM,并且包括 KN0340mM, (NH4) 2S045mM, MgSO4.7H200.75mM, ΚΗ2Ρ042.93mM,CaCl2.2H201.13mM。
5.根据权利要求1所述的方法，所述第一预定时间段为15分钟；所述第二预定时间段为48小时。
6.根据权利要求1所述的方法，所述步骤3包括选取分裂旺盛的愈伤组织收集至50mL的无菌离心管中与农杆菌接触。
7.一种生产转基因水稻的方法，包括: 1)通过权利要求1-6中任一所述的方法将预定外源基因导入水稻细胞；和 2)利用导入了所述外源基因的水稻细胞培育水稻植株。
8.一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下组分: (1)愈伤组织 诱导培养基； (2)农杆菌悬浮培养基； (3)前筛选培养基； (4)筛选培养基； (5)分化再生培养基； (6)生根培养基，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基、所述农杆菌悬浮培养基、所述分化再生培养基中[NO3-]/[NH4+] = 40mM/10mM。
【文档编号】A01H5/00GK103981214SQ201410235525
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】李 浩, 杨剑波, 魏鹏程, 杨亚春, 倪大虎, 李莉, 倪金龙, 陆徐忠, 宋丰顺, 马卉, 秦瑞英 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所