一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种玉米幼胚高效诱导继代培养基，由包括维生素母液1.5mL、诱导愈伤培养基1L和硝酸银溶液100μL制备而成，诱导愈伤培养基由包括：N6培养基粉末3.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.002-0.004g/L，脯氨酸2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物0.1-0.2g/L，肌醇0.1-0.3g/L，蔗糖30-40g/L，吗啉乙磺酸0.5g/L。其制备方法包括灭菌；诱导愈伤培养基原料溶解、定容、调pH值，加入植物凝胶，高温灭菌；冷却，加入维生素母液、硝酸银溶液，制得诱导继代培养基。本发明愈伤诱导率高、生长速度快、培养基效期长，从诱导愈伤到愈伤的持续继代培养，使用同一种培养基。
【专利说明】一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及玉米组织培养【技术领域】，具体涉及一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法。
【背景技术】
[0002]玉米是一种重要的单子叶模型植物，广泛应用于基因组学、分子生物学、遗传学等研究。玉米幼胚所诱导的愈伤在遗传转化、研究植物生长发育规律、种质快繁、种质改良等方面具有重要意义。目前，玉米幼胚诱导愈伤过程中主要使用的培养基配置程序繁琐、继代时间间隔短、耗费人工、存在愈伤畸形率及褐化率高等问题，限制了幼胚诱导愈伤的应用。
【发明内容】
[0003]针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法，具有简便易行、操作简便、提高愈伤诱导率等优点。
[0004]为实现上述目的，本发明提供一种玉米幼胚高效诱导继代培养基，由包括维生素母液1000*1.5mL、诱导愈伤培养基IL和硝酸银溶液100 μ L制备而成。
[0005]所述诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成:Ν6培养基粉末3.99g/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.002-0.004g/L，脯氨酸 2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物 0.1-0.2g/L，肌醇 0.1-0.3g/L，蔗糖 30-40g/L,吗啉乙磺酸(MES)0.5g/L。
[0006]优选的，所述诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成:N6培养基粉末
3.99g/L，2，4-二氯苯氧乙酸0.003g/L，脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.lg/L,蔗糖35g/L，吗啉乙磺酸0.5g/L。
[0007]优选的，所述维生素母液由包括下述组分的原料制备而成:维生素B10.6g/L、维生素 B60.6g/L、烟酸 0.5g/L,泛酸 0.5g/L。
[0008]优选的，所述硝酸银溶液的浓度为50mM。
[0009]本发明还提供了上述培养基的制备方法，包括以下步骤:
[0010]I)将维生素母液、硝酸银溶液灭菌，-20°C保存备用；
[0011]2)将诱导愈伤培养基原料溶解，定容至1L，调PH值至5.8，加入植物凝胶，将诱导愈伤培养基进行高温灭菌；
[0012]3)诱导愈伤培养基冷却至50°C时，加入维生素母液、硝酸银溶液，制得诱导继代培养基。
[0013]优选的，所述步骤2)中植物凝胶的加入量为2_4g/L。
[0014]优选的，步骤I)中所述灭菌为抽滤灭菌或高温灭菌。
[0015]进一步地,步骤I)中所述灭菌为抽滤灭菌。
[0016]优选的，步骤2)中所述高温灭菌的温度为121°C，灭菌时间为30min。
[0017]优选的，步骤3)制得诱导继代培养基分装入90mm无菌培养皿中，50皿，密封，4-20°C保存，培养基效期为60天。
[0018]本发明还提供了上述制备方法制得的培养基应用于玉米愈伤组织的诱导和继代培养。
[0019]本发明与现有技术相比，具有以下优点:
[0020]I)本发明额外配置维生素母液，抽滤灭菌，在培养基灭菌后，冷却至50°C添加，充分保持了维生素的活性，保证了维生素的抗氧化性及愈伤的营养供应。有别于现有技术添加维生素粉末，经过高温灭菌，活性丧失。特别添加酪蛋白水解物促进愈伤生长。
[0021]2)本发明中从诱导愈伤到愈伤的持续继代培养，都只使用了一种培养基，有别于现有技术中首先使用诱导愈伤培养基(诱导幼胚生成愈伤)，两周后使用继代培养基(持续培养愈伤)。因此，便于操作，节约成本。
[0022]3)本发明中得到的愈伤褐化率低于现有技术的50%，且畸形愈伤不足I %，在现有技术中畸形愈伤率为5%。
[0023]4)本发明得到的愈伤繁殖率高，为97%以上，高于现有技术的60%以上。
[0024]5)本发明愈伤诱导率高、生长速度快、培养基效期长，适用于商业化玉米愈伤诱导。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为实施例1中诱导出的玉米Hi II愈伤。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]试验开始10天后，根据幼胚是否膨大，判定愈伤诱导率。
[0028]试验开始45天后(此时受体材料继代一次以上，愈伤状态有明显差异)，根据愈伤状态，判定畸形率及褐化率。
[0029]愈伤状态:
[0030]I型:白色，结构致密，坚硬，干燥，表面皱起，生长速度缓慢，易发生器官分化，不能长期继代；
[0031]II型:乳白色，结构松散，较湿润，可以长期继代；
[0032]III型:黄褐色，水浸状，生长慢的愈伤，不能长期继代。
[0033]公式:
[0034]愈伤诱导率=膨大的幼胚数/幼胚总数；
[0035]畸形率=I型愈伤数/愈伤总数；
[0036]褐化率= III型愈伤数/愈伤总数。
[0037]实施例1
[0038]1、玉米幼胚高效诱导继代培养基的配方
[0039]由包括维生素母液、诱导愈伤培养基和硝酸银溶液制备而成，
[0040]维生素母液由包括下述组分的原料制备而成:维生素B1.6g/L、维生素B60.6g/L、烟酸 0.5g/L，泛酸 0.5g/L；
[0041]诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成:N6培养基粉末3.99g/L，2，4- 二氯苯氧乙酸0.003g/L,脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.lg/L,蔗糖35g/L,吗啉乙磺酸0.5g/L。
[0042]2、培养基的制备方法
[0043]包括以下步骤:
[0044]I)将维生素母液、硝酸银溶液进行抽滤灭菌，-20°C保存备用；
[0045]2)将诱导愈伤培养基原料溶解，调PH值至5.8，加入植物凝胶3g/L，将诱导愈伤培养基进行高温灭菌，灭菌的温度为121°C，灭菌时间为30min。；
[0046]3)诱导愈伤培养基冷却至50°C时，加入维生素母液1.5mL, 50mM的硝酸银溶液100 μ L，制得诱导继代培养基，分装入90mm无菌培养皿中，50皿，密封，4_20°C保存，培养基效期为60天。
[0047]3、玉米Hi II幼胚高效诱导愈伤
[0048]I)幼穗选取:选取自花授粉10-12天的玉米Hi II幼穗，要求生长良好、无虫口，玉米籽粒成乳白色，尚未灌浆。
[0049]2)去掉玉米穗的苞叶，于75%酒精中浸泡5min，其间不时搅动，使其充分消毒灭菌，然后将酒精滤除，这是第一步灭菌。
[0050]3)在上一步的基础上，重新加入75%酒精，浸泡15min，其间不时搅动，使其充分消毒灭菌，这是第二步灭菌， 然后滤除酒精，幼穗放入超净工作台备用。
[0051]4)用解剖刀在玉米粒底部将玉米粒从玉米棒上剥下，将解剖刀插入玉米粒中，将幼胚取出。
[0052]5)将幼胚转移到诱导继代培养基，使盾片朝上，90mm培养皿中接种60个幼胚，培养条件为25 °C，暗培养。
[0053]6) 7天后，对膨大的I型愈伤进行继代，培养基同步骤5)，90mm培养皿中接种50块愈伤。
[0054]7)此后，每15天继代一次，随着愈伤的增加，培养皿中的愈伤块数逐渐减少，保证每块愈伤来自一个幼胚。这时的愈伤蓬松，色白，大小均一，无组织结构。
[0055]8)30天后，将来自一个幼胚的愈伤分成50mm*50mm的小块，90mm培养皿中接种30块愈伤，完成了愈伤诱导。
[0056]参见图1，诱导出的玉米Hi II愈伤已经继代4次，可见愈伤蓬松，呈乳白色。
[0057]实施例2
[0058]诱导愈伤培养基中酪蛋白水解物的组分为0.4g/L。其余过程同实施例1。
[0059]实施例3
[0060]在培养基的制备过程中，维生素母液在步骤I)中不进行灭菌，只在步骤2)中进行高温灭菌。其余过程同实施例1。
[0061]实施例4
[0062]诱导愈伤培养基中不添加酪蛋白水解物，维生素母液在步骤I)中不采用高温灭菌替代抽滤灭菌。其余过程同实施例1。
[0063]实验例I
[0064]表1、实施例1-4对愈伤诱导及生长的影响。
[0065]
【权利要求】
1.一种玉米幼胚高效诱导继代培养基，其特征在于，由包括维生素母液1.5mL、诱导愈伤培养基IL和硝酸银溶液100 μ L制备而成， 所述诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成:Ν6培养基粉末3.99g/L，2，4- 二氯苯氧乙酸0.002-0.004g/L，脯氨酸2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物0.1-0.2g/L，肌醇0.1-0.3g/L,鹿糖 30-40g/L,吗啉乙磺酸 0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，由包括维生素母液1.5mL、诱导愈伤培养基IL和硝酸银溶液100 μ L制备而成， 所述诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成:Ν6培养基粉末3.99g/L，2，4- 二氯苯氧乙酸0.003g/L,脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.lg/L，蔗糖35g/L,吗啉乙磺酸0.5g/L。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述维生素母液由包括下述组分的原料制备而成:维生素B1.6g/L、维生素B60.6g/L、烟酸0.5g/L、泛酸0.5g/L。
4.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述硝酸银溶液的浓度为50mM。
5.如权利要求1-4任一所述培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将维生素母液、硝酸银溶液灭菌，-20°C保存备用； 2)将诱导愈伤培养基原料溶解，定容至1L，调PH值至5.8，加入植物凝胶，将诱导愈伤培养基进行高温灭菌； 3)诱导愈伤培养基冷却至50°C时，加入维生素母液、硝酸银溶液，制得诱导继代培养基。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中植物凝胶的加入量为2_4g/L。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤I)中所述灭菌为抽滤灭菌或高温灭菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤I)中所述灭菌为抽滤灭菌。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述高温灭菌的温度为121°C，灭菌时间为30min。
10.如权利要求1-4任一所述培养基应用于玉米愈伤组织的诱导和继代培养。
【文档编号】C05G3/00GK104130058SQ201410356552
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】宋新元, 王大铭, 刘金文, 刘娜, 龙丽坤, 武奉慈 申请人:吉林省农业科学院