一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用，以羽叶三七的cDNA文库为模版，引物P1:5'ATGGAACTCGGGAGGAGTT3'；引物P2:5'TTACATTTTTTTAGTAATGG3'；进行PCR扩增，可获得羽叶三七鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到羽叶三七中，可提高羽叶三七中总皂苷的含量，为羽叶三七总皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
【专利说明】
—种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，主要涉及羽叶三七中鲨烯环氧酶基因的克隆和应用，
【背景技术】
[0002]羽叶三七(Panaxjaponicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu etΚ.Μ.Feng)属于五加科人参属(Panax L.)植物,是传统的名贵药材之一,具有较高的药用价值，如清热解毒、顺气健胃、活血祛疲、滋补强壮等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。
[0003]羽叶三七是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值，目前中国羽叶三七的野生资源近于濒危，通过研究羽叶三七中活性成分三萜皂苷类化合物的生物合成途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。
[0004]S烯环氧酶(Squalene epoxidase, SQE)基因在三職类阜苷的生物合成途径中起着重要的作用。SQE通过在C-C之间插入I个氧原子催化角鲨烯生成中间体单氧态角鲨烯，此中间体在强光和紫外线的作用下可生成2，3_氧化角鲨烯。而2，3-氧化角鲨烯是三萜类化合物——植物留醇、达玛烯二醇、环阿乔醇的前体，其合成直接关系羽叶三七中三萜类皂苷的含量，目前，SQE被公认为是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶之一。
[0005]本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行羽叶三七全株的转录组测序及Denovo拼接。分析找到羽叶三七中编码鲨烯环氧酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能。为羽叶三七三萜皂苷化合物的生物合成提供理论基础。
[0006]在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其氨基酸序列。此基因编码的鲨烯环氧酶在羽叶三七中三萜皂苷化合物的生物合成的过程中具有重要的作用，本专利认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来研究羽叶三七中三萜皂苷化合物生物合成的关键点。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因，其序列为SEQ IDN 0.1所示。该基因被公认为是人参属植物活性成分三萜皂苷合成的关键基因，进而为人参属植物中三萜皂苷含量的提高提供技术手段。
[0008]本发明的另一个目的是提供羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示，
[0009]本发明的最后一个目的在于提供羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因在在提高羽叶三七中三萜皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到羽叶三七中，可提高羽叶三七中三萜皂苷的含量。
[0010]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0011]一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因(以下称为PjSQE基因)，其制备方法如下:
[0012]以羽叶三七的cDNA文库为模版，引物Pl: 5’ ATGGAACTCGGGAGGAGTT3，;引物P2:5’ TTACATTTTTTTAGTAATGG3’ ；PCR 反应条件:94°C 预变性 5min ;94°C变性 lmin, 52.6°C退火50s, 72°C延伸lmin, 30个循环；72°C延伸1min0
[0013]最终获得了 PjSQE基因，其序列为SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示。
[0014]一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因在提高三萜类皂苷的含量中的应用，其应用过程如下:
[0015]将羽叶三七鲨烯环氧酶蛋白质(SEQ ID N0.2所示)对应的PjSQE基因(优选SEQI D N0.1所示的核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，可获得高三萜皂苷含量的的转基因植株。
[0016]本发明的所要保护的内容还包括:
[0017]编码SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0018]含有本发明的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pC AMBIA 系列载体，pRTL。
[0019]含有本发明的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围，包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、羽叶三七细胞或羽叶三七发根细胞。
[0020]本发明的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体，包括但不限于烟草，拟南芥，酵母羽叶三七发根。
[0021]本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
[0022]利用本发明的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0023]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0024]本发明所提供的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因是首次从羽叶三七植物中克隆制备所得，利用本发明的技术可以对羽叶三七等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的三萜皂苷化合物的含量。羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因可参与羽叶三七三萜皂苷化合物的生物合成，因此本申请为羽叶三七三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
[0025]本发明利用转基因技术得到了三萜皂苷含量增加的高产株，为三萜皂苷的的工业化生产提供了技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
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[0026]图1为羽叶三七总RNA电泳图。
[0027]图2为PjSQE功能域预测分析。
[0028]图3为PjSQE系统进化树。
[0029]图4为表达载体pYEUra3_PjSQE构建示意图。
[0030]图5为酶促反应产物薄层色谱分析。
【具体实施方式】
[0031]本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。
[0032]实施例1:
[0033]羽叶三七转录组测序及数据分析
[0034]1、样品采集
[0035]羽叶三七(Panaxjaponicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu etΚ.M.Feng)植株来源于湖北恩施，分别取根茎，叶，花，果实置液氮中速冻后，在_80°C冰箱中冷冻保存备用。
[0036]2、羽叶三七总RNA的分离和检测
[0037]对_80°C保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并适当加大巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和巯基乙醇后，采用高浓度NaAc溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性(图1)，用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于_80°C冰箱备用。
[0038]3、转录组测序(RNA-Seq)
[0039]用oligo(dT)的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly (A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代SolexaHiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
[0040]4、候选基因初步筛选
[0041]通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树(图3)等软件分析初步筛选到羽叶三七中编码鲨烯环氧酶的候选基因。
[0042]实施例2:
[0043]羽叶三七鲨烯环氧酶基因的克隆
[0044]分析候选基因读码框范围，羽叶三七根茎、叶、花或果实的cDNA利用正向引物Pl: 5' ATGGAACTCGGGAGGAGTT3';反向引物 P2:5’ TTACATTTTTTTAGTAATGG3’ 克隆候选基因全长序列，链接到克隆载体PMD18-T载体上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5a中，步骤如下:
[0045]a)从_80°C超低温冰箱中取100 μ L感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
[0046]b)加入5 μ L连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min ；
[0047]c) 42°C热激90s，迅速置冰上5min ；
[0048]d)向EP管中加入ImL LB液体培养基(不含抗生素)，37°C 200rpm 45min ；
[0049]e)摇菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培养箱过夜；
[0050]f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养过夜选取阳性克隆送样测序。
[0051]至此获得了羽叶三七鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
[0052]实施例3:
[0053]PjSQE基因的生物信息学分析
[0054]本发明涉及的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全长为1629bp，其序列为SEQ IDN0.1所示，其中开放读码框位于I?1629bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID N0.2所示。将拼接分析好的鲨烯环氧酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。该基因具有典型的SE superf ami Iy结构域，如图2。
[0055]实施例4:
[0056]PjSQE基因功能的研究
[0057]1、表达载体的构建
[0058]依据羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全长序列(SEQ ID N0.1)的0RF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点BamHI和 Xhol，利用正向引物 P15’ GGATCCATGGAACTCGGGAGGAGTT3，;反向引物 P2:5’ CTCGAGTTACATTTTTTTAGTAATGG3’进行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为1641bp，TA克隆，提取质粒。以BamHI和XhoI酶切扩增产物2h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamHI和XhoI酶在37°C下酶切pYEUra3载体2h，进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收大小约6152bp的片段。
[0059]二者经连接酶在16°C连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒，进行限制性内切酶酶切电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒PYEUra3-PjSQE用于表达转化。该表达载体命名为 pYEUra3-PjSQE(图 4)。
[0060]2、蛋白的诱导表达
[0061]以pYEUra3_PJSQE质粒转化部分酶解酵母宿主菌AB1380，培养5d后筛选阳性酵母于2ml含2%葡萄糖的USM培养基上，4_5d后挑取单克隆2ml USM液体培养基中，30°C剧烈震荡培养过夜。5000rpm离心培养5min，弃上清，以含2%葡萄糖的USM液体培养基稀释20倍，30°C剧烈震荡培养24h。提取培养细胞总蛋白。选取高表达转化子以50ml含2%葡萄糖的USM液体培养基30°C剧烈震荡培养20h后，接种到IL不含葡萄糖的USM液体培养基30°C剧烈震荡培养40h，回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。
[0062]3、酶促反应鉴定
[0063]体外酶促反应体系总体积为300ul，其中含有67mM Tris-HCL (pH7.5)，ImM EDTA,ImM NADPH,0.1mM FAD,0.1% Triton X-100,0.075% Tween80 和[3H]鲨烯(20000dpm)力口入纯化的表达蛋白，然后置于75°C孵育60min，添加0.3ml 10%的甲醇氢氧化钾终止反应，用2ml的环己烷萃取2次后在氮气流下使反应物浓缩。用硅胶薄层色谱法进行分析(Art558.Merck, Darmstadt, Germany),然后在苯:乙酸乙酯99.5:0.5中展开。用液体闪烁计数器计量放射性活度(TR1-CARB2500RT, Packard Instrument Co, Downers Grove, IL)。
[0064]对表达纯化的鲨烯环氧酶进行酶活力的检测，加入纯化的表达蛋白到反应体系
0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5),0.02umol细胞色素C，0.1umol NADPH中，总体积为1ml。添加NADPH来引发反应。以每分钟每克蛋白减少Iumol细胞色素c定义为一个酶活性单位。
[0065]结果为如图5，第一条泳道为空白组，第二条没有添加鲨烯环氧酶抑制剂AM01618，第三条添加了 30mM的鲨烯环氧酶抑制剂AM01618，第四条泳道为标准品。空白组和添加了鲨烯环氧酶抑制剂的泳道都没有检测出2，3-氧化鲨烯，只有第三天泳道有2，3-氧化鲨烯，说明此基因编码的蛋白质发挥了催化作用。
[0066]实施例5:
[0067]羽叶三七鲨烯环氧酶基因或多肽在提高羽叶三七总皂苷含量中的应用:
[0068]转基因用的受体材料羽叶三七(Panax japonicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu et Κ.M.Feng)米自湖北恩施。
[0069]采用本领域的常规技术，根据羽叶三七鲨烯环氧酶基因的全长cDNA序列(SEQ IDN0.1所示)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，筛选转基因植株检测其总皂苷的含量。
[0070]具体步骤如下:
[0071]以实施例2中获得的含有PJSQE基因编码区的PMD18-T的质粒为模版依据羽叶三七P JSQE基因全长序列(SEQ ID N0.1)的0RF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和Sail，利用正向引物Pl:5’GGTACCATGGAACTCGGGAGGAGTT3’ ；反向引物 P2:5’GTCGACTTACATTTTTTTAGTAATGG3’ 进行 PCR 反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为1641bp，TA克隆，提取质粒。
[0072]用KpnI和SalI双酶切含目的基因序列PJSQE和原核表达载体质粒pBI 121，酶切产物经琼脂糖电泳后回收相应的片段，PBI 121载体与PJSQE目的基因片段经T4DNA连接酶在8-16°C下进行连接反应16h，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，用50ug/mL卡那霉素筛选，挑取阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒并进行酶切鉴定，将酶切鉴定好的表达载体PB 1-PJSQE转入农杆菌中，遗传转化羽叶三七。
[0073]利用发根农杆菌介导的羽叶三七的遗传转化，所需的材料和操作步骤如下:
[0074]I)发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28 °C培养过夜。
[0075]2)取羽叶三七细嫩叶片，洗净后置于70%酒精中浸泡lmin，弃酒精，加入2%次氯酸钠消毒lOmin，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4?5次，置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将羽叶三七叶片切成5mmX5mm小片，置于预培养固体培养基上，在(23±1)°C暗箱培养箱中预培养2d。
[0076]3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4°C中2h后取出。将预培养过的羽叶三七叶片浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，(23±1) °C黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中I次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再将阳性株转移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
[0077]4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养25d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存-80°C中备用。
[0078]阳性株利用常规real-time PCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如下:
[0079]提取具有卡那霉素抗性的转化羽叶三七植株的RNA，反转录成cDNA，半定量PCR。Pj SQE 基因特异引物 Pl:5" GGTACCATGGAACTCGGGAGGAGTT 3’ ；反向引物 P2:5’￡ICGACTTACATTTTTTTAGTAATGG 3’，反应程序采用 TaKaRa 两步法:95 °C 预变性 30s，95 °C变性5s，60°C延伸34s，40个循环。用羽叶三七的actin基因做为内参基因，正向引物5’ -GGAAAAGATTTGGCATC-3’，反向引物 5’ -GGGCGTAACCCTCATA-3’ 对羽叶三七的野生型和转化型在相同生长状态下进行目的基因表达水平的分析。最终选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上(P〈0.01)的转化植株作为阳性株进行后续的研究。
[0080]5)含羽叶三七鲨烯环氧酶基因的转基因发根的总皂苷含量测定
[0081]根据2010版《中华人民共和国药典》，人参属植物中的皂苷都为三萜皂苷。
[0082]转基因羽叶三七发根中总皂苷含量的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤:
[0083]参考袁丁等(华西药学杂志，2008，23 (6) =692-694)的总皂苷待测溶液处理方法及检测方法，采用香草醛-高氯酸比色法对过表达羽叶三七PjSQE基因的转基因发根系进行羽叶三七总皂苷含量测定，以非转基因的羽叶三七发根系为对照。标准品为人参皂苷Re，购自中国药品生物制品检定所(批号:110754-200421)。
[0084]对照组和转基因组均检测8株。
[0085]测定结果发现，在过表达羽叶三七PjSQE基因的转基因羽叶三七发根中羽叶三七总皂苷含量比非转基因对照组提高了 1.4倍(P〈0.05)。由此证明，羽叶三七鲨烯环氧酶PjSQE基因对促进羽叶三七总皂苷类化合物含量的提高有显著作用，羽叶三七鲨烯环氧酶PjSQE基因可用于利用转基因技术提高羽叶三七总皂苷含量的研究和产业化中，具有一定的应用前景。
【权利要求】
1.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQID N0.1所示。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5.含有权利要求4所述植物表达载体的转基因植株。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物总皂苷含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高羽叶三七总皂苷含量中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104232597SQ201410446359
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】张绍鹏, 陈平, 赵小龙, 汪琪, 朱闻君, 伍翀, 王如峰, 邓琛, 郑用琏 申请人:张绍鹏, 陈平, 赵小龙, 汪琪, 朱闻君, 伍翀, 王如峰, 邓琛, 郑用琏, 霍梦蕊