一种黄麻的组织培养快繁方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄麻的组织培养快繁方法，即以茎尖为外植体建立了黄麻离体快繁体系，为黄麻转基因育种提供实验材料。本发明以茎尖为外植体，通过愈伤组织诱导、分化培养、不定芽诱导、根苗诱导以及试管苗驯化移栽等过程实现了黄麻的组织培养快速繁殖，对黄麻转基因研究具有重要的应用价值。
【专利说明】 一种黄麻的组织培养快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种黄麻的组织培养快繁方法。
【背景技术】
[0002]黄麻是椴树科黄麻属一年生草本韧皮纤维作物，也是世界上重要的长纤维作物之一，是麻纺工业的重要原料，世界上黄麻的产量和种植面积仅次于棉花。黄麻具纤维产量高，吸湿性强、透气性好等优点。
[0003]在其他麻类作物的离体快速繁殖、原生质体质分离培养、体细胞胚发生和器官发生等组织培养方面已取得了较大的突破，但由于过去黄麻韧皮纤维应用范围仅限于编制麻袋、经济效益低下，导致对黄麻作物的研究较为滞后，至今为止，尚未见有关黄麻离体再生体系系统的所道，这严重制约着黄麻遗传育种研究的发展。因此，非常有必要建立系统的黄麻离体快繁体系，为今后对黄麻进行品质遗传改良奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种黄麻的组织培养快繁方法，本发明以茎尖为外植体，通过愈伤组织诱导、分化培养、不定芽诱导、根苗诱导以及试管苗驯化移栽等过程实现了黄麻的组织培养快速繁殖，对黄麻转基因研究具有重要的应用价值。
[0005]本发明的一种黄麻的组织培养快繁方法，包括以下的工艺步骤:
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的黄麻种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗10?30min，于超净工作台中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，无菌水冲洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，无菌水冲洗3?5次后用无菌滤纸吸干表面的水分，并接种于种子萌发培养基中于每天光照10?11小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至得到无菌苗。
[0006](2)愈伤组织诱导:剪取无菌苗茎尖部分约0.2?0.3cm,并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?10天，然后置于每天光照10?16小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成愈伤组织。
[0007](3)增殖培养:愈伤组织生长至15?25天后，将长势良好的愈伤组织转接至增殖培养基中进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?7天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，15?20天转接一次。
[0008](4)分化培养:将培养至15?20天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养2?5天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽。
[0009](5)生根培养:将分化出的不定芽长至2?3cm接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至长出根。
[0010](6)试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中。
[0011]上述步骤(I)所述的种子萌发培养基为:MS+ 0.1?0.3mg/LGA3+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0012]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+0.1?1.0mg/L TDZ+1.0?2.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0014]上述步骤(4)所述的分化培养基为:MS+1?2mg/L 6-BA+0.1?0.5mg/LNAA+100 ?200mg/L HC+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0015]上述步骤(5)所述的生根培养基为:MS+0.1?0.5mg/L 6-BA+1?2mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0016]目前尚未见有关黄麻离体再生体系系统的所道，这严重制约着黄麻遗传育种研究的发展。因此，本发明的实施可为今后对黄麻进行品质遗传改良奠定基础。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0018]实施例1
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的黄麻种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗lOmin，于超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用含有0.01%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干表面的水分，并接种于种子萌发培养基中于每天光照10小时，光照强度为1500x，培养温度为25°C的条件下培养直至得到无菌苗，所述的萌发培养基为:MS+ 0.lmg/LGA3+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，PH值为5.8。
[0019](2)愈伤组织诱导:剪取无菌苗茎尖部分约0.2?0.3cm,并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在25°C条件下全暗培养5天，然后置于每天光照10小时，光照强度为15001x，培养温度为25°C的条件下培养35天即可形成愈伤组织，愈伤组织诱导率为85%。所述的诱导培养基为:MS+0.lmg/L TDZ+1.0mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.8。
[0020](3)增殖培养:愈伤组织生长至15天后，将长势良好的愈伤组织转接至增殖培养基中进行增殖培养，接种后先在25°C条件下全暗培养5天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为25°C的条件下培养，15天转接一次。所述的增殖培养基为:MS+0.lmg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值为 5.8。
[0021](4)分化培养:将培养至15天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在25°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为25V的条件下培养18天即可形成不定芽。所述的分化培养基为:MS+lmg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+100mg/L HC+2.0% 蔗糖+0.4% 琼脂+0.05% 活性炭，pH 值为
5.8。
[0022](5)生根培养:将分化出的不定芽长至2?3cm接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在25°C条件下全暗培养9天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为25°C的条件下培养14天即长出根。
[0023](6)试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中，移栽成活率达91%。
[0024]实施例2
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的黄麻种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗20min，于超净工作台中以80%乙醇溶液浸泡15s，无菌水冲洗4次，再用含有0.03%吐温-20的0.5%升汞溶液消毒7min，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干表面的水分，并接种于种子萌发培养基中于每天光照11小时，光照强度为2000x，培养温度为28°C的条件下培养直至得到无菌苗，所述的萌发培养基为:MS+ 0.4mg/LGA3+2.5%蔗糖+0.38%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。
[0025](2)愈伤组织诱导:剪取无菌苗茎尖部分约0.2?0.3cm,并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在28°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为28°C的条件下培养37天即可形成愈伤组织，愈伤组织诱导率为88%。所述的诱导培养基为:MS+0.2mg/L TDZ+1.3mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.8。
[0026](3)增殖培养:愈伤组织生长至15天后，将长势良好的愈伤组织转接至增殖培养基中进行增殖培养，接种后先在28°C条件下全暗培养6天，然后置于每天光照13小时，光照强度为25001x，培养温度为28°C的条件下培养，18天转接一次。所述的增殖培养基为:MS+0.5mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值为 5.8。
[0027](4)分化培养:将培养至15天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在28°C条件下全暗培养4天，然后置于每天光照15小时，光照强度为25001x，培养温度为25V的条件下培养20天即可形成不定芽。所述的分化培养基为:MS+1.2mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+180mg/L HC+2.0% 蔗糖 +0.4% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值为5.8。
[0028](5)生根培养:将分化出的不定芽长至2?3cm接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养10天，然后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，培养温度为28°C的条件下培养17天即长出根。
[0029](6)试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中，移栽成活率达93%。
【权利要求】
1.一种黄麻的组织培养快繁方法，其特征在于包括以下工艺步骤: (1)外植体的处理:选取当年收饱满的黄麻种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗10?30min，于超净工作台中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，无菌水冲洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，无菌水冲洗3?5次后用无菌滤纸吸干表面的水分，并接种于种子萌发培养基中于每天光照10?11小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至得到无菌苗； (2)愈伤组织诱导:剪取无菌苗茎尖部分约0.2?0.3cm,并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?10天，然后置于每天光照10?16小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成愈伤组织； (3)增殖培养:愈伤组织生长至15?25天后，将长势良好的愈伤组织转接至增殖培养基中进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?7天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，15?20天转接一次； (4)分化培养:将培养至15?20天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养2?5天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽； (5)生根培养:将分化出的不定芽长至2?3cm接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至长出根； (6)试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中。
2.根据权利要求1所述的一种黄麻的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(I)所述的种子萌发培养基为:MS+ 0.1?0.3mg/LGA3+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种黄麻的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+0.1 ?L Omg/L TDZ+1.0 ?2.0mg/L NAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种黄麻的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1 ?1.0mg/L NAA+1.0 ?2.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
5.根据权利要求1所述的一种黄麻的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(4)所述的分化培养基为:MS+1 ?2mg/L 6-BA+0.1 ?0.5mg/L NAA+100 ?200mg/L HC+2.0% ?2.5%蔗糖+0.4%?0.6%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
6.根据权利要求1所述的一种黄麻的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(5)所述的生根培养基为:MS+0.1 ?0.5mg/L 6-BA+1 ?2mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
【文档编号】A01H4/00GK104285817SQ201410607817
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】杨业容 申请人:杨业容