本发明涉及一种蝉花的人工培养方法。
背景技术：
蝉花(Isaria cicadae Miquel)属于真菌界(FUNGI)的子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草科(Cordycipitaceae)、棒束孢属(Isaria)，是我国名贵的中药材，是寄生在蝉(俗称“知了”)上的一种虫草菌。其药用已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方面的药用价值。主要成分有腺苷、虫草多糖、虫草酸(甘露醇)、虫草素、尿嘧啶、甾醇、生物碱、维生素、无机盐、矿物质元素等。
蝉花具有独特而广泛的功效，如改善肾功能，抗肿瘤，调节免疫系统，滋补强壮，提高细胞能力、抗疲劳，降血压、血糖，解热、镇痛、改善睡眠，改善脂质代谢，促进造血，抗真菌，抗衰老等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蝉花的人工培养方法，该方法培养得到的蝉花子实体粗壮、产量高。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种蝉花的人工培养方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；
步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；
步骤3，对子实体进行采收；
其中，在步骤2固体培养过程中控制二氧化碳浓度不超过1200PPM。
进一步，步骤2固体培养过程中控制二氧化碳浓度不超过1000PPM。
更进一步，步骤2固体培养过程中控制二氧化碳浓度为500～800PPM。
进一步，步骤2所述固体培养分为暗培养和光培养阶段，在菌丝体生长阶段为暗培养；从子实体始发至采收阶段为光培养。步骤2在固体培养过程中的光培养阶段控制二氧化碳浓度。
进一步，步骤2所述固体培养的培养条件为：暗培养阶段培养温度20-25℃，相对湿度为70-80％；光培养阶段培养温度为20-22℃，相对湿度为70-80％。
更进一步，步骤2光培养阶段光照强度为100-200Lx。
更进一步，步骤2光培养阶段每天通风2～3次，每次0.5～1小时。
进一步，步骤1扩大培养的培养温度为20～25℃。
进一步，步骤1所述扩大培养包括斜面培养和液体培养；更进一步，所述液体培养包括摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的任意一种或几种。
进一步，步骤2固体培养的接种量为5％～15％；更进一步，接种量为7％～12％。
进一步，步骤2固体培养阶段培养基含水量为55-65％。
进一步，步骤3对子实体进行采收后还包括步骤4对子实体进行干燥。
本发明斜面培养、液体培养和固体培养所采用的培养基均为本领域常规培养基；
所述斜面培养的培养基可以是PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂-水，pH自然)、PSA(土豆煮汁-白砂糖-琼脂粉-水)、SDAY(酵母浸出粉-葡萄糖-蛋白胨-琼脂)、MPA(麦芽糖-蛋白胨-琼脂-水)、CA(玉米粉-琼脂粉-水)、Czapek(NaNO3-K2HPO4-KCl-MgSO4·7H2O-FeSO4·7H2O-蔗糖-琼脂-蒸馏水)、SDA(葡萄糖-蛋白胨-琼脂-水)。优选PDA培养基。
所述液体培养的培养基可以是PS(马铃薯-蔗糖-水)、Richard(KNO3-KH2PO4-MgSO4-蔗糖-FeCl3-水)、PGY(蛋白胨-葡萄糖-酵母膏-水)、YSPS(酵母抽提物-大豆分离蛋白/复合氨基酸-白砂糖-水)。优选YSPS培养基。
所述固体培养的培养基可以是谷物培养基、农作物秸杆培养基、农作物皮壳培养基、经济林木树枝培养基等。所述谷物培养基选自以小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意 一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物秸秆培养基选自以麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物皮壳培养基选自以麸皮、大豆皮、棉籽壳中的任意一种或几种为主要原料的培养基。更进一步，所述固体培养基优选谷物培养基。
本发明创造性的发现固体培养过程中二氧化碳浓度会对子实体生长产生显著影响。当二氧化碳浓度高于1200PPM时，会导致提前产孢，子实体矮小，产量降低。因此，本发明将固体培养阶段二氧化碳浓度控制在1200PPM以下，能显著提高蝉花子实体的产量和质量。
具体实施方式
以下实施例所用菌种来源：
实施例1～6所用菌种保藏号为CGMCC No3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)；实施例7～10所用菌种为自制菌种，制备过程见实施例27；本发明研究表明蝉花菌种类型并不构成影响本发明效果的因素，本发明方法对不同蝉花菌种均能够实现效果。
以下实施例中测定的子实体高度和直径均为平均值。
实施例1扩大培养
1、培养过程
斜面培养→摇瓶培养→种子罐培养→发酵罐培养；
2、培养基
斜面培养基：PSA培养基(土豆煮汁200g、白砂糖20g、琼脂粉20g，余量水补足1L)；
液体培养基：YSPS培养基(酵母提取物5g、大豆分离蛋白10g、白砂糖35g，余量水补足1L)；
培养基要经过灭菌，确保达到无菌状态；
3、培养条件
摇瓶培养阶段：转速：150r/min，温度：25℃，时间：培养55～60h；
种子罐培养阶段：转速：150r/min，1.5vvm，温度：25℃，时间：培养24～36h；
发酵罐培养阶段：转速：150r/min，1.5vvm，温度：25℃，时间：培养24～36h。
实施例2扩大培养
1、培养过程
斜面培养→一级摇瓶培养→二级摇瓶培养→种子罐培养；
2、培养基与实施例1相同。
3、培养条件
一级摇瓶培养阶段：转速：120r/min，温度：22℃，时间：培养55～60h；
二级摇瓶培养阶段：转速：120r/min，温度：22℃，时间：培养30～36h；接种量5％；
种子罐培养阶段：转速：120r/min，0.8vvm，温度：22℃，时间：培养30～36h。
实施例3扩大培养
1、培养过程
斜面培养→摇瓶培养→种子罐培养；
2、培养基与实施例1相同；
3、培养条件
摇瓶培养阶段：转速：140r/min，温度：23℃，时间：培养55～60h；
种子罐培养阶段：转速：140r/min，1.0vvm，温度：23℃，时间：培养30～36h。
实施例4扩大培养
与实施例1基本相同，区别仅在于斜面培养基为：PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1L，pH自然)。
实施例5扩大培养
与实施例1基本相同，区别仅在于斜面培养基为：SDAY培养基(酵母浸出粉10.0g，葡萄糖40.0g，蛋白胨10.0g，琼脂20.0g，pH值6.0±0.1)。
实施例6扩大培养
与实施例1基本相同，区别仅在于斜面培养基为：MPA培养基(麦芽糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1L)
实施例7扩大培养
与实施例2基本相同，区别仅在于斜面培养基为：CA培养基(玉米粉4g，琼脂粉8g，蒸馏水1L，pH6.0)。
实施例8扩大培养
与实施例2基本相同，区别仅在于液体培养基为：Richard培养基(KNO310g，KH2PO45g，MgSO42.5g，蔗糖50g，FeCl30.02g，蒸馏水1L)。
实施例9扩大培养
与实施例3基本相同，区别仅在于液体培养基为：PGY培养基(蛋白胨5g，葡萄糖10g，酵母膏10g，蒸馏水1L)。
实施例10扩大培养
与实施例3基本相同，区别仅在于液体培养基为：PS培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1L)。
实施例11固体培养
固体培养基：小麦和水按1：1.5的比例混合均匀，灭菌；
接种：将实施例1～3任一扩大培养得到的液体种子按固体培养基10％的比例接种到固体培养基中；
培养条件：
暗培养阶段：温度为25℃，相对湿度80％，至菌丝长满培养基(约3～5天)；
光培养阶段：温度为22℃，相对湿度80％，光照强度100lux，每天通风2次(上、下午各通风1次，每次半小时)，二氧化碳浓度为1000PPM，培养时间约20～24天；及时采收并干燥。
实施例12固体培养
与实施例11基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为800PPM。
实施例13固体培养
与实施例11基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为500PPM。
实施例14固体培养
与实施例11基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为1200PPM。
实施例15固体培养
与实施例11基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为1500PPM。
实施例11～实施例15培养结果
取实施例1～3制备的液体种子分别按实施例11～15的方法进行固体培养，考察光培养阶段不同二氧化碳浓度对子实体生长的影响，结果见表1。
表1实施例11～15不同二氧化碳浓度对子实体生长的影响
上述结果表明，二氧化碳浓度超过1200PPM会导致子实体矮小，产量降低。浓度在500-800PPM范围内最有利于子实体生长。
实施例16固体培养
固体培养基：大米和水按1:1.3的比例混合均匀，灭菌；
接种：将实施例4～6任一扩大培养得到的液体种子按固体培养基11％的比例接种到固体培养基中；
培养条件：
暗培养阶段：温度为23℃，相对湿度70％，至菌丝长满培养基(约3～5天)；
光培养阶段：温度为20℃，相对湿度70％，光照强度200lux，每天通风2次(上、下午各通风1次，每次半小时)，二氧化碳浓度为1000PPM，培养时间约20～24天；及时采收并干燥。
实施例17固体培养
与实施例16基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为800PPM。
实施例18固体培养
与实施例16基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为500PPM。
实施例19固体培养
与实施例16基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为1500PPM。
实施例16～实施例19培养结果
取实施例4制备的液体种子分别按实施例16～19的方法进行固体培养，考察子实体形态和产量，结果见表2。
表2实施例16～19不同二氧化碳浓度对子实体生长的影响
上述结果表明，二氧化碳浓度超过1200PPM会导致子实体矮小，产量降低。浓度在500-800PPM范围内最有利于子实体生长。
实施例20固体培养
固体培养基：小米和水按1:1.3的比例混合均匀，灭菌；
接种：将实施例7～8任一扩大培养得到的液体种子按固体培养基9％的比例接种到固体培养基中；
培养条件：
暗培养阶段：温度为20℃，相对湿度65％，至菌丝长满培养基(约5～8天)；
光培养阶段：温度为22℃，相对湿度65％，光照强度100lux，每天通风2次(上、下午各通风1次，每次半小时)，二氧化碳浓度为1000PPM，培养时间约20～24天；及时采收并干燥。
实施例21固体培养
与实施例20基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为800PPM。
实施例22固体培养
与实施例20基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为500PPM。
实施例23固体培养
与实施例20基本相同，区别仅在于光培养二氧化碳浓度为1500PPM。
实施例20～实施例23培养结果
实施例7制备的液体种子分别按实施例20～23的方法进行固体培养，考察子实体形态和产量，结果见表3。
表3实施例20～23不同二氧化碳浓度对子实体生长的影响
上述结果表明，二氧化碳浓度超过1200PPM会导致子实体矮小，产量降低。浓度在500-800PPM范围内最有利于子实体生长。
实施例24固体培养
固体培养基：大麦和水按1:1.5的比例混合均匀，灭菌；
接种：取实施例9～10任一扩大培养得到的液体种子按固体培养基5％的比例接种到固体培养基中；
培养条件与实施例11相同。
实施例25固体培养
固体培养基：玉米秸粉50％、麦杆粉20％、棉花秸20％、黄豆粉5％、玉米粉5％，灭菌；含水量60％；
接种：取实施例9～10任一扩大培养得到的液体种子按固体培养基15％的比例接种到固体培养基中；
培养条件与实施例11相同。
实施例26固体培养
固体培养基：麦麸皮35％、稻壳粉20％、菜籽壳粉35％、黄豆粉5％、玉米粉5％，灭菌；含水量65％；
接种与培养条件与实施例11相同。
实施例24～实施例26培养结果
实施例9～10任一制备的液体种子分别按实施例24～26的方法进行固体培养，其子实体高度均高于10.5cm，产量高于10.3％。
实施例27
在我国长江以南的亚热带和热带地区低洼地带，7月，按照一般中药材的方法采集。在超镜工作台上，在无菌条件下，将采来的新鲜虫草用无菌水冲洗干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分(虫体)用打湿的脱脂棉包裹，以保湿。虫草的子实体下方放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片垫起，以使可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约0.5cm左右。然后将培养皿放置于20℃±0.5℃的光照培养箱培养，待蝉花孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的PDA培养基少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑取少量菌丝转另一平皿(SDAY培养基)培养(同上)，直至长出单一的纯化的菌落为止。并经形态学或分子生物学方法验证，该菌株为蝉花虫草(Isaria cicadae Miquel)无性型。