技术领域本发明属于烟草抗病育种技术领域，具体涉及一种烟草疫霉接种创伤烟苗根系的方法。
背景技术：
烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthoranicotianae)侵染烟草根茎部引起的一种分布广泛、危害严重的烟草病害，在我国各主要产烟区均有不同程度发生，控制这个病害最经济有效的方法是选用抗病品种。为寻找抗病品种通常需要进行品种的抗病性鉴定。通常，烟草品种的抗病性鉴定多以烟苗根部或根茎部为对象接种烟草疫霉，然后统计烟苗的发病情况得出烟苗抗病性，例如应用较多的室内菌谷接种抗病评价（GB/T23224），然而这种方法在移栽烟苗、培育成活后，需要对每株烟苗定量接种、再保湿培养，尤其是烟苗品种繁多，数量大时会导致工作量非常大，并且要占用很多空间才能完成，因此这种方法仅适用于区试品种或少量品种的抗病性鉴定；还有就是洗根浸根接种法，先对幼苗进行洗根，再将幼苗固定在漂浮盘，然后浸根接种再进行抗病性鉴定，但是这种方法中洗根对烟苗根系造成的伤害太大且难以控制，接种时烟苗根部接触游动孢子的表面积大，导致发病往往偏重，并不能反映烟苗田间抗病性。为此，研发一种能够同时鉴定大量烟苗品种，工作量小、效率高，且能准确反映烟苗田间抗病性的创伤烟苗根系接种烟草疫霉的方法是解决上述问题的关键。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种烟草疫霉接种创伤烟苗根系的方法。本发明的目的是这样实现的，包括（1）第一阶段育苗、（2）第二阶段育苗、（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、（4）根部创伤浸根接种、（5）抗病性鉴定，具体步骤如下：（1）第一阶段育苗：将烟草种子播于带基质的第一漂浮育苗盘中育苗30~40天，再锻苗2~3天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的第二漂浮育苗盘中，育苗10~20天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗，筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，菌丝块经液体培养诱导产生游动孢子囊，然后经低温处理促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水1~2天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种24~36小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，共调查3~4次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明的漂浮育苗同时育苗多个烟苗品种，创伤烟苗根系后浸入接种，再进行培养观察后鉴定，可实现大规模数量的烟草品种抗病性鉴定，有效提高抗病性鉴定效率，特别适合从数量庞大的种质资源中筛选抗病靶标品种；2、本发明采用两段式漂浮育苗和浅盘接种，移苗、接种方便，减少了不同操作人员间的人为误差，同时节省了鉴定时间，节约人力劳动成本，并且占用空间小，易于管理；3、本发明中的刮根过程的技术对烟苗根部造成的创伤量稳定，接种时烟苗根部接触游动孢子的表面积稳定且一致，鉴定结果能够准确反映烟苗田间的抗病性；4、本发明的浅盘在对烟苗浸根并定量接种，侵染过程更接近田间自然侵染，抗病性选择压力合适，抗病性鉴定结果能够准确反映烟苗田间的抗病能力。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。一种烟草疫霉接种创伤烟苗根系的方法，包括（1）第一阶段育苗、（2）第二阶段育苗、（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、（4）根部创伤浸根接种、（5）抗病性鉴定，具体步骤如下：（1）第一阶段育苗：将烟草种子播于带基质的第一漂浮育苗盘中育苗30~40天，再锻苗2~3天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的第二漂浮育苗盘中，育苗10~20天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗、筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，菌丝块经液体培养诱导产生游动孢子囊，然后经低温处理促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水1~2天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种24~36小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，共调查3~4次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。所述的步骤（2）中筛选须根长势一致的烟苗为穿过漂浮盘的须根数量有8~16条，须根长4~5厘米，且呈纯白色。所述的第一漂浮育苗盘为300~400孔漂浮育苗盘，第二漂浮育苗盘为100~200孔漂浮育苗盘，且第一漂浮育苗盘的面积与第二漂浮育苗盘的面积相等。所述的步骤（2）中筛选须根长势一致的烟苗后，一个第二漂浮盘中每个品种烟苗的数量至少12株，且第二漂浮盘的数量不少于3个，即每个品种烟苗的总数量不少于36株。所述的步骤（4）中浅盘的水位为1~2cm，温度为25~28℃、相对湿度75%以上。所述的步骤（2）中剪叶是沿烟苗叶尖剪除展开叶片的1/3~1/2，然后剪去烟株下部的2-4片黄叶和老叶的全部叶子和叶柄。所述的步骤（3）中液体培养是将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，再用灭菌水冲洗3~5次，然后每天换灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生。所述的步骤（3）中低温处理是当菌丝块游动孢子囊在104/cm2个以上时，于5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子。所述的步骤（5）中漂浮培养的温度为22~30℃。所述的步骤（1）中锻苗是将第一漂浮盘从漂浮池中拿出，通风沥水2~3天。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1~5中烟草疫霉为0号生理小种（中华人民共和国烟草行业标准YC/T39-1996）。调查是以株为单位调查所有接种烟苗，其中根茎部变黑、烟苗凋萎记作发病，根茎部不变色、烟苗直立、生长正常记作不发病。实施例1（1）第一阶段育苗：将烟草种子播于带基质的第一漂浮育苗盘中育苗30天，再锻苗2天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的第二漂浮育苗盘中，育苗10天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗、筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25℃下黑暗培养7天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，菌丝块经液体培养诱导产生游动孢子囊，然后经低温处理促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水1天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种24小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，调查是以株为单位调查所有接种烟苗，共调查4次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。实施例2（1）第一阶段育苗：将烟草种子播于带基质的第一漂浮育苗盘中育苗40天，再锻苗3天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的第二漂浮育苗盘中，育苗20天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗、筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于28℃下黑暗培养10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，菌丝块经液体培养诱导产生游动孢子囊，然后经低温处理促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水2天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种36小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，调查是以株为单位调查所有接种烟苗，共调查4次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。实施例3（1）第一阶段育苗：将烟草种子播于带基质的第一漂浮育苗盘中育苗35天，再锻苗2.5天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的第二漂浮育苗盘中，育苗15天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗、筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于26℃下黑暗培养8天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，菌丝块经液体培养诱导产生游动孢子囊，然后经低温处理促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水1.5天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种30小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，调查是以株为单位调查所有接种烟苗，共调查3次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。实施例4（1）第一阶段育苗：将红花大金元、NC71、K326、Beinhart1000-1品种的烟草种子按顺序播于360孔的第一浮育苗盘中育苗30天，再锻苗2天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的122孔第二漂浮育苗盘中，育苗15天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗、筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于27℃下黑暗培养8天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，菌丝块经液体培养诱导产生游动孢子囊，然后经低温处理促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水1天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，然后在浅盘中对烟苗进行接种，其中浅盘水位1厘米，温度27℃，相对湿度75%以上，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种33小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，共调查3次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。试验结果见表1。表1红花大金元、NC71、K326、Beinhart1000-1的抗病性鉴定结果由表1可知，红花大金元是高感品种，NC71、Beinhart1000-1是抗病品种，K326是中抗品种。NC71、Beinhart1000-1、K326是抗性材料。进行5个不同批次的试验，5个批次的烟草品种的黑胫病发病率稳定在各自的范围内，重复性符合实验要求，且与4个品种公开的抗病性高度吻合。结果表明本发明鉴定烟草抗黑胫病的结论是准确的。实施例5（1）第一阶段育苗：将N.rustica、N.nudicaulis、N.longiflora、翠碧1号、G28、G80、TN86、KY17、红花大金元、K326、Beinhart1000-1、Coker371、L8、金星6007、革新3号、云烟85、小黄金1025、NC89、NC82、Florida301、NC71、NC1071共22个品种的烟草种子按顺序播于325孔的第一浮育苗盘中育苗35天，再锻苗2.5天，然后挑选出整齐一致的幼苗；（2）第二阶段育苗：将步骤（1）挑选出的幼苗连同基质移栽至无基质的162孔第二漂浮育苗盘中，育苗12天，将幼苗培育至须根穿过第二漂浮盘进入漂浮池，然后剔除弱苗、筛选须根长势一致的烟苗，再进行剪叶，得到须根烟苗，以备接种；（3）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于26℃下黑暗培养8天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子，再用无菌水调节游动孢子浓度至104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；（4）根部创伤浸根接种：将步骤（2）获得的须根烟苗连同第二漂浮育苗盘一起拿出沥水2天，再刮除第二漂浮育苗盘底部外露的须根，将步骤（3）得到的烟草疫霉游动孢子悬浮液置入浅盘中，然后将第二育苗盘浸到浅盘中，然后在浅盘中对烟苗进行接种，其中浅盘水位2厘米，温度26℃，相对湿度75%以上，于12h光照12h黑暗交替条件下，在浅盘中对烟苗维持接种28小时；（5）抗病性鉴定：接种后的烟苗继续漂浮培养，每7天调查一次烟苗黑胫病的发病率a，共调查3次，以最高一次发病率调查结果作为病情进行统计划分抗感性，发病率a=0为免疫或高抗品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤45%为中抗品种，发病率45%＜a≤65%为中感品种，发病率65%＜a≤80%为感病品种，发病率80%＜a≤100%为高感品种，其中免疫或高抗、抗病、中抗的品种即为抗性材料。试验结果见表2。表2N.rustica等22个烟草品种的抗病性鉴定结果由表2可知，N.nudicaulis是免疫品种，共1个；N.rustica、N.longiflora、Beinhart1000-1、Coker371、L8、革新3号、NC82、Florida301、NC71、NC1071是抗病品种，共10个；K326、金星6007、云烟85、NC89是中抗品种，共4个；G28、G80是感病品种，共2个，翠碧1号、TN86、KY17、红花大金元、小黄金1025是高感品种，共5个。N.nudicaulis、N.rustica、N.longiflora、Beinhart1000-1、Coker371、L8、革新3号、NC82、Florida301、NC71、NC1071、K326、金星6007、云烟85、NC89为抗性材料，共15个。按本发明方法对22个烟草品种的抗黑胫病的鉴定结果与22个烟草品种已公开的抗黑胫病的鉴定结果一致，表明本发明的鉴定结果是准确的。