一种异花授粉植物愈伤组织高频再生系的获得方法及其在遗传转化中的应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种异花授粉植物愈伤组织高频再生系的获得方法及其在遗传转化中的应用。

背景技术：

野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麦属一种多年生兼性盐生优良牧草，又叫短芒大麦草，是一种典型的异花授粉植物。主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，可在含盐量0.6～1.0％(质量百分比)的土地上良好生长，它的耐盐性可与小花碱茅等媲美，具有重要的应用和科学研究价值。目前，野大麦耐盐分子机理和耐盐基因功能解析方面研究较少。野大麦的离体再生鲜有报道，偶有报道开展了遗传转化的研究，但转化效率较低。截止目前，仍未建立稳定的野大麦遗传转化体系，极大的限制了野大麦以离体再生为基础的转基因育种和基因功能分析的深入开展。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供获得同一基因型的异花授粉植物愈伤组织高频再生系。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种异花授粉植物离体再生的方法。

本发明所提供的异花授粉植物离体再生的方法，是以所述异花授粉植物单株的幼穗或用所述幼穗截成的节段为外植体，完成离体再生。

所述异花授粉植物的幼穗为发育至1.5～2.5cm(如1.5cm、2cm或2.5cm)的幼穗。

所述节段的长度为0.2～0.4cm(如0.2cm、0.3cm或0.4cm)。

按照上述方法进行离体再生获得的再生苗的基因型为同一基因型。而异花授粉植物，一般获得的资源材料或品种均为混合基因型。

所述异花授粉植物离体再生的方法可包括如下步骤：

(1)将所述外植体接种于诱导培养基进行培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基中含有2～4mg/L 2，4-D、30～40g/L蔗糖和0.4～0.6g/L水解酪蛋白；

(2)将步骤(1)获得的愈伤组织置于继代培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；所述继代培养基中含有0.8～1.2mg/L 2，4-D、30～40g/L蔗糖和0.4～0.6mg/L 6-BA；

(3)将步骤(2)获得的胚性愈伤组织置于分化培养基甲进行培养，获得分化苗；分化培养基甲中含有0.8～1.2mg/L 6-BA、0.15～0.25mg/L玉米素和30～40g/L蔗糖；

(4)将步骤(3)获得的分化苗置于生根培养基甲进行培养，获得再生苗；所述生根培养基甲中含有20～30g/L蔗糖。

所述诱导培养基具体可为含有3mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖和0.5g/L的水解酪蛋白的MS固体培养基。

所述继代培养基具体可为含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖和0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)的MS固体培养基。

所述分化培养基甲具体可为含有1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的玉米素(Zeatin，ZT)和35g/L的蔗糖的MS固体培养基。

所述生根培养基甲具体可为含有25g/L的蔗糖的1/2MS固体培养基。

所述步骤(1)中，所述培养的条件可为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，暗培养4～5周(如4周或5周)。

所述步骤(2)中，所述培养的条件可为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，暗培养9～12周(如9周、10周、11周或12周)。“将步骤(1)获得的愈伤组织”可为愈伤诱导率高于75％以上的单株的愈伤组织。

所述步骤(3)中，所述培养的条件可为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，光暗交替培养5～8周(如5周、6周、7周或8周)。“将步骤(2)获得的胚性愈伤组织”可为胚性愈伤率高于70％以上的单株的胚性愈伤组织。

所述步骤(4)中，所述培养的条件可为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，光暗交替培养4～7周(如4周、5周、6周或7周)。“将步骤(3)获得的分化苗”可为分化率高于80％以上的单株的分化苗。

上述任一所述异花授粉植物离体再生的方法在异花授粉植物遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了异花授粉植物愈伤组织高频再生系的获得方法。

本发明所提供的异花授粉植物愈伤组织高频再生系的获得方法，可包括如下步骤：

(1)以异花授粉植物单株的幼穗或用所述幼穗截成的节段为外植体，将所述外植体接种于所述诱导培养基进行培养，获得愈伤组织；

(2)完成步骤(1)后，取愈伤诱导率高于75％以上的单株的愈伤组织，置于所述继代培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；

(3)完成步骤(2)后，取胚性愈伤率高于70％以上的单株的胚性愈伤组织，置于所述分化培养基甲进行培养，获得分化苗；

(4)完成步骤(3)后，取分化率高于80％以上的单株的分化苗，置于所述生根培养基甲进行培养，获得再生苗。

上述异花授粉植物愈伤组织高频再生系的获得方法中，所述异花授粉植物的幼穗为发育至1.5～2.5cm(如1.5cm、2cm或2.5cm)的幼穗。所述节段的长度为0.2～0.4cm(如0.2cm、0.3cm或0.4cm)。所述高频再生系可为愈伤诱导率高于75％以上、胚性愈伤率高于70％以上和分化率高于80％以上的异花授粉植物单株的幼穗所诱导出的愈伤组织总称。

按照上述异花授粉植物愈伤组织高频再生系的获得方法，获得的异花授粉植物愈伤组织高频再生系为同一基因型。

上文中，所述愈伤诱导率的计算公式为：愈伤诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数×100％。

上文中，所述胚性愈伤率的计算公式为：胚性愈伤率＝产生胚性愈伤组织数/接种的外植体总数×100％。

上文中，所述分化率的计算公式为：分化率＝分化出苗的愈伤组织数/接种于分化培养基上的愈伤组织数×100％。

为解决上述技术问题，本发明还提供了异花授粉植物的遗传转化方法。

本发明所提供的异花授粉植物的遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)以异花授粉植物单株的幼穗或用所述幼穗截成的节段为外植体，将所述外植体接种于诱导培养基进行培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基中含有2～4mg/L 2，4-D、30～40g/L蔗糖和0.4～0.6g/L水解酪蛋白；

(2)完成步骤(1)后，将所述愈伤组织置于继代培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；所述继代培养基中含有0.8～1.2mg/L 2，4-D、30～40g/L蔗糖和0.4～0.6mg/L6-BA；

(3)完成步骤(2)后，对所述胚性愈伤组织进行遗传转化。

上述遗传转化方法，所述步骤(3)中，所述“对所述胚性愈伤组织进行遗传转化”依次可包括如下步骤：

(A)取重组农杆菌，对所述胚性愈伤组织进行侵染；所述重组农杆菌是将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到的；

(4)完成步骤(A)后，取所述胚性愈伤组织，进行干化处理；

(5)完成步骤(4)后，取所述胚性愈伤组织，置于共培养基，共培养；所述共培养基中含有0.8～1.2mg/L 2，4-D、0.4～0.6mg 6-BA、30～40g/L蔗糖和40～60mg/L乙酰丁香酮；

(6)完成步骤(5)后，取所述胚性愈伤组织，依次置于一次筛选培养基、二次筛选培养基和三次筛选培养基上进行培养，获得抗性愈伤组织；所述一次筛选培养基中含有2，4-D 0.8～1.2mg/L、蔗糖30～40g/L、特美汀120～180mg/L和潮霉素15～25mg/L；所述二次筛选培养基中含有2，4-D 0.8～1.2mg/L、蔗糖30～40g/L、特美汀120～180mg/L和潮霉素20～30mg/L；所述三次筛选培养基中含有2，4-D 0.8～1.2mg/L、蔗糖30～40g/L、特美汀120～180mg/L和潮霉素25～35mg/L；

(7)完成步骤(6)后，取所述抗性愈伤组织，置于分化培养基乙进行培养，获得分化苗；所述分化培养基乙中含有6-BA 0.8～1.2mg/L、玉米素0.15～0.25mg/L和蔗糖30～40g、特美汀120～180mg/L和潮霉素15～25mg/L；

(8)完成步骤(7)后，取所述分化苗，依次置于生根培养基乙和生根培养基丙培养，获得转基因苗；所述生根培养基乙中含有蔗糖20～30g/L、特美汀120～180mg/L和潮霉素25～35mg/L；所述生根培养基丙中含有蔗糖20～30g/L、特美汀120～180mg/L和潮霉素45～55mg/L。

所述诱导培养基具体可为含有3mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖和0.5g/L的水解酪蛋白的MS固体培养基。

所述继代培养基具体可为含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖和0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)的MS固体培养基。

所述共培养基可为向侵染培养基中加入琼脂，至其浓度为6～8g/L，得到的培养基。

所述共培养基可为向侵染培养基中加入琼脂，至其浓度为7g/L，得到的培养基。

每1L所述侵染培养基的溶质具体可为：NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、KH₂PO₄170mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、FeSO₄·7H₂O 27.80mg、Na₂EDTA 37.30mg、MnSO₄·4H₂O 22.30mg、ZnSO₄·7H₂O 8.60mg、H₃BO₃ 6.20mg、KI 0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、C_OCl₂·6H₂O 0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、2，4-D 1.0mg、6-BA 0.5mg、蔗糖35g和乙酰丁香酮50mg，所述侵染培养基的溶剂为水，所述侵染培养基的pH值为5.1～5.3(如5.1、5.2或5.3)。

所述一次筛选培养基具体可为含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和20mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

所述二次筛选培养基具体可为含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和25mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

所述三次筛选培养基具体可为含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和30mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

所述分化培养基乙具体可为含有1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的ZT和35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和20mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

所述生根培养基乙具体可为含有25g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和30mg/L的潮霉素的1/2MS固体培养基。

所述生根培养基丙具体可为含有25g/L的蔗糖和50mg/L的潮霉素的1/2MS固体培养基。

所述步骤(1)中，所述培养的条件为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，暗培养4～5周(如4周或5周)。所述异花授粉植物的幼穗为发育至1.5～2.5cm(如1.5cm、2cm或2.5cm)的幼穗。所述节段的长度为0.2～0.4cm(如0.2cm、0.3cm或0.4cm)。

所述步骤(2)中，所述培养的条件为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，暗培养9～12周(如9周、10周、11周或12周)。

所述步骤(A)中，所述“侵染”的方法可如下：将侵染菌液滴在所述胚性愈伤组织的表面，然后真空处理5～15min(如5min、10min或15min)；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液。所述真空可为0.4～0.6个大气压。所述侵染菌液的制备方法为：将所述重组农杆菌悬浮于所述侵染培养基。所述侵染菌液的OD_600nm值为0.4～0.6。

所述步骤(4)中，所述“干化处理”的方法可如下：将所述胚性愈伤组织置于无菌条件下干燥培养。所述“干化处理”的方法具体可为将所述胚性愈伤组织移至铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，在超净工作台处理一天。

所述步骤(5)中，所述培养的条件为：25℃～27℃(如25℃、26℃或27℃)，暗培养3～4天(如3天或4天)。

所述步骤(6)中，所述培养的条件为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，光暗交替培养8～10周(如8周、9周或10周)。

所述步骤(7)中，所述培养的条件为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，光暗交替培养6～8周(如6周、7周或8周)。

所述步骤(8)中，所述培养的条件为：25℃～28℃(如25℃、26℃、27℃或28℃)，光暗交替培养4～7周(如4周、5周、6周或7周)。通过上述遗传转化方法获得的转基因苗，均以同一基因型材料进行的遗传转化。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于异花授粉植物离体再生的试剂盒甲或用于异花授粉植物遗传转化的试剂盒乙。

所述试剂盒甲含有所述诱导培养基和/或所述继代培养基和/或所述分化培养基甲和/或所述生根培养基甲。

所述试剂盒乙含有所述诱导培养基和/或所述继代培养基和/或所述共培养基和/或所述一次筛选培养基和/或所述二次筛选培养基和/或所述三次筛选培养基和/或所述分化培养基乙和/或所述生根培养基乙和/或所述生根培养基丙。

上述任一所述异花授粉植物可为单子叶异花授粉植物。所述单子叶异花授粉植物具体可为野大麦。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物的遗传转化方法。

本发明所提供的植物的遗传转化方法，包括步骤(a1)或(a2)：

(a1)将侵染菌液滴在植物愈伤组织表面；

(a2)将所述侵染菌液滴在植物愈伤组织表面，干化处理。

所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到。

上述植物的遗传转化方法中，所述愈伤组织可为胚性愈伤组织。

所述步骤(a1)中，所述“将侵染菌液滴在植物愈伤组织表面”还包括真空处理5～15min的步骤(如5min、10min或15min)。所述真空可为0.4～0.6个大气压。

所述步骤(a2)中，所述“干化处理”的方法可如下：将所述植物愈伤组织置于无菌条件下干燥培养。所述“干化处理”的方法具体可为将所述植物愈伤组织移至铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，在超净工作台处理一天。

上述植物的遗传转化方法中，所述植物可为异花授粉植物。所述异花授粉植物可为单子叶异花授粉植物。所述单子叶异花授粉植物具体可为野大麦。

上文中，所述异花授粉植物幼穗的获得方法为：将异花授粉植物种子播种于营养土培养，然后移栽大田，第二年从叶鞘中取幼穗。

上文中，所述光暗交替培养即光照培养和暗培养交替。光照培养时的光照强度为2000Lx。光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

上文中，所述MS固体培养基的制备方法可为：将NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、KH₂PO₄ 170mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、FeSO₄·7H₂O 27.80mg、Na₂EDTA37.30mg、MnSO₄·4H₂O 22.30mg、ZnSO₄·7H₂O 8.60mg、H₃BO₃ 6.20mg、KI 0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、C_OCl₂·6H₂O 0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg和琼脂7g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8。

上文中，所述1/2MS固体培养基的制备方法可为：将NH₄NO₃ 825mg、KNO₃ 950mg、KH₂PO₄ 85mg、MgSO₄·7H₂O 185mg、CaCl₂·2H₂O 220mg、FeSO₄·7H₂O 13.90mg、Na₂EDTA18.65mg、MnSO₄·4H₂O 11.15mg、ZnSO₄·7H₂O 4.30mg、H₃BO₃ 3.10mg、KI 0.415mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.125mg、CuSO₄·5H₂O 0.0125mg、C_OCl₂·6H₂O 0.0125mg、肌醇50.00mg、VB₁0.05mg、VB₆0.25mg、烟酸0.25mg、甘氨酸1.0mg和琼脂7g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8。

异花授粉植物，一般获得的资源材料或品种均为混合基因型。而实验证明，本发明所提供的异花授粉植物离体再生方法获得的再生苗的基因型为同一基因型，利用该方法可筛选获得同一基因型的异花授粉植物愈伤组织高频再生系；通过该高频再生系遗传转化异花授粉植物，具有以下两方面的优点：一为每个独立的转化体属于相同基因型，既有利于外源基因在转基因株系中的表达分析，又有利于转基因株系和亲本对照株系间进行表型等方面的比较分析，对异花授粉植物来说十分必要；二为获得转基因株系的效率较高，该高频再生系不仅是高转化率的保障，而且能够保存，以后可直接利用，省去筛选基因型的繁琐程序，节省人力和物力。因此，本发明所提供的方法具有重要的应用价值。

附图说明

图1为离体再生的过程。

图2为分子检测结果。

图3为GUS染色分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

MS固体培养基：将NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、KH₂PO₄ 170mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、FeSO₄·7H₂O 27.80mg、Na₂EDTA 37.30mg、MnSO₄·4H₂O 22.30mg、ZnSO₄·7H₂O 8.60mg、H₃BO₃ 6.20mg、KI 0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O0.025mg、C_OCl₂·6H₂O 0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg和琼脂7g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8。

1/2MS固体培养基：将NH₄NO₃ 825mg、KNO₃ 950mg、KH₂PO₄ 85mg、MgSO₄·7H₂O 185mg、CaCl₂·2H₂O 220mg、FeSO₄·7H₂O 13.90mg、Na₂EDTA 18.65mg、MnSO₄·4H₂O 11.15mg、ZnSO₄·7H₂O 4.30mg、H₃BO₃ 3.10mg、KI 0.415mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.125mg、CuSO₄·5H₂O 0.0125mg、C_OCl₂·6H₂O 0.0125mg、肌醇50.00mg、VB₁0.05mg、VB₆0.25mg、烟酸0.25mg、甘氨酸1.0mg和琼脂7g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8。

诱导培养基：含有3mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖和0.5g/L的水解酪蛋白的MS固体培养基。

继代培养基：含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖和0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)的MS固体培养基。

分化培养基甲：含有1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的玉米素(Zeatin，ZT)和35g/L的蔗糖的MS固体培养基。

生根培养基甲：含有25g/L的蔗糖的1/2MS固体培养基。

LB抗性培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母膏、5g NaCl、1g D-葡萄糖、30mg利福平和100mg卡那霉素溶于1L蒸馏水，调节pH值至7.0。

侵染培养基：将NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、KH₂PO₄ 170mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、FeSO₄·7H₂O 27.80mg、Na₂EDTA 37.30mg、MnSO₄·4H₂O 22.30mg、ZnSO₄·7H₂O 8.60mg、H₃BO₃ 6.20mg、KI 0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O0.025mg、C_OCl₂·6H₂O 0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、2，4-D 1.0mg、6-BA 0.5mg、蔗糖35g和乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)50mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.2。

共培养基：向侵染培养基中加入琼脂，至其浓度为7g/L，得到的培养基。

一次筛选培养基：含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和20mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

二次筛选培养基：含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和25mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

三次筛选培养基：含有1.0mg/L的2，4-D、35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和30mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

分化培养基乙：含有1.0mg/L的6-BA、0.2mg/L的ZT和35g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和20mg/L的潮霉素的MS固体培养基。

生根培养基乙：含有25g/L的蔗糖、150mg/L的特美汀和30mg/L的潮霉素的1/2MS固体培养基。

生根培养基丙：含有25g/L的蔗糖和50mg/L的潮霉素的1/2MS固体培养基。

质粒pTCK303记载于如下文献中：Wang Z.，Chen C.B.，Xy Y.Y.，Jiang R.X.，Han Y.，Xu Z.H.，Chong K.A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice(Oryza sativa L.).2004.Plant Molecular Biology Reporter22(4):409–417.

GUS反应混和液：溶质及其浓度为10mmol/L EDTA-Na₂、0.5mmol/L K₃Fe(CN)₆、0.5mmol/L K₄Fe(CN)₆·3H₂O、1mg/mL X-gluc和0.1％(体积百分比)TritonX-100，溶剂为蒸馏水；pH值为7.0。

实施例1、同一基因型的野大麦愈伤组织高频再生系的获得方法

野大麦为异花授粉植物，一般获得的资源材料或品种均为混合基因型。由于不同基因型的组织培养再生能力和遗传转化效率均不同，因此提供同一基因型的野大麦愈伤组织高频再生系对野大麦的组织培养或/和基因研究至关重要。

本发明提供的同一基因型的野大麦愈伤组织高频再生系的获得方法，是以野大麦单株幼穗为外植体。野大麦为多分蘖型禾本科植物，一个单株在抽穗期可同时抽出多个幼穗，为获得同一基因型的野大麦愈伤组织高频再生系提供了必要物质条件。

同一基因型的野大麦愈伤组织高频再生系的获得方法如下：

一、愈伤组织系(以下简称为愈伤系)的诱导

1、选取饱满的野大麦种子，播种于温室中盛有营养土的花盆，待野大麦幼苗长至两叶一心期时，移栽入北京市农林科学院科研试验田。移栽后的第二年，待野大麦返青后充足浇水，对野大麦单株进行编号(见图1中(a))，一个单株即为一个系(即同一基因型的材料)，一个系所有幼穗诱导出的全部愈伤组织为一个愈伤系。待幼穗发育至1.5～2.5cm时，用剪刀从野大麦基部将茎剪下，剥除外部的叶鞘，得到幼穗(见图1中(b)，为保证野大麦幼穗生长状态较好，取幼穗前再次浇水)。

2、完成步骤1后，将幼穗置于超净工作台，先用70％(体积百分比)的乙醇水溶液擦洗表面，然后用无菌解剖针划开内部的叶鞘，轻轻转动幼穗结节处，抽出被包裹的幼穗，用无菌镊子将该外植体截成0.2cm～0.4cm的节段，接种于诱导培养基上(接种时以系为单位，并编号)，25℃暗培养5周，得到白色且结构不紧实的愈伤组织。

二、愈伤系的继代

完成步骤一后，以系为单位统计愈伤诱导率(愈伤诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数×100％)，将愈伤诱导率高于75％以上的愈伤系的愈伤组织接种于继代培养基上，25℃暗培养12周(继代期间每隔3周换一次新的继代培养基)，得到黄色且结构紧实的胚性愈伤组织(图1中(c))和非胚性愈伤组织。

通过扫描电镜观察胚性愈伤组织，结果表明，胚性愈伤组织表面有许多未分化的胚性细胞团结构(图1中(d))，而非胚性愈伤组织表面无此结构。

三、愈伤系的分化

完成步骤二后，以系为单位统计胚性愈伤率(胚性愈伤率＝产生胚性愈伤组织数/接种的外植体总数×100％)，将胚性愈伤率高于70％以上的愈伤系的胚性愈伤组织接种于分化培养基甲上，光暗交替培养6周(分化培养期间每隔3周换一次新的分化培养基甲)，得到分化苗(图1中(e))。其中光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)条件为：25℃。光照培养时的光照强度为2000Lx，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

四、愈伤系的生根和再生苗的获得

完成步骤二后，以系为单位统计分化率(分化率＝分化出苗的愈伤组织数/接种于分化培养基上的愈伤组织数×100％)，将分化率高于80％以上的愈伤系的分化苗转入生根培养基甲进行光暗交替培养，待根长长至3cm以上时(培养时间约4～7周)即完成再生苗的生根，获得健壮的再生苗(图1中(f)、(g)和(h))。其中光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)条件为：25℃。光照培养时的光照强度为2000Lx，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

五、移栽

取步骤四获得健壮的再生苗，去掉封口膜炼苗，然后将再生苗从三角瓶中取出，洗去根上附着的生根培养基甲，移栽入预先高压灭菌的蛭石和草炭土1﹕1(体积比)基质中于温室中培养(图1中(i))，前期注意保湿遮阴，3～5天后逐渐增加透光量，一周后可常规管理，幼苗移栽成活率达90％以上。

经过上述步骤，获得了3个高频再生愈伤系(高频再生愈伤系指的是愈伤诱导率高于75％以上、胚性愈伤率高于70％以上和分化率在80％以上的单株幼穗所诱导出的愈伤组织总称)，分别命名为愈伤系S1、愈伤系S2和愈伤系S3，以系为单位统计3个高频再生愈伤系的发生频率，结果发生频率均为10％(发生频率＝高频再生愈伤系数/接种的单株数)。

实施例2、运用实施例1的同一基因型的野大麦愈伤组织高频再生系建立野大麦遗传转化方法

一、获得胚性愈伤组织

1、取愈伤系S1的野大麦的幼穗，剥除外部叶鞘并置于超净工作台，先用70％(体积百分比)的乙醇水溶液擦洗表面，然后用无菌解剖针划开幼嫩的叶鞘，轻轻转动幼穗结节处，抽出被包裹的幼穗并作为外植体，用无菌镊子将该外植体截成0.2cm～0.4cm的节段，接种于诱导培养基上，25℃暗培养4周，得到白色且结构不紧实的愈伤组织。

2、完成步骤1后，将白色且结构不紧实的愈伤组织接种于继代培养基上，25℃暗培养9周(继代期间每隔3周换一次新的继代培养基)，得到黄色且结构紧实的胚性愈伤组织。

二、农杆菌侵染液的制备

1、采用电击法将质粒pTCK303转化根癌农杆菌GV3101，挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/pTCK303。

2、将步骤1获得的GV3101/pTCK303单克隆接种到LB抗性培养基，28℃、160rpm振荡培养12h，得到培养菌液。将该培养菌液5000rpm、离心10min，收集的菌体用侵染培养基重悬，得到农杆菌侵染液。以侵染培养基的OD_600nm为参照，调整农杆菌侵染液的OD_600nm值至0.4～0.6。

三、侵染胚性愈伤组织

将胚性愈伤组织转移至铺有无菌滤纸的无菌培养皿，然后用农杆菌侵染液进行滴染转化，以保证每块胚性愈伤组织被农杆菌侵染液浸染，但又不浸泡于农杆菌侵染液中。滴染转化的操作步骤具体为：用移液器将农杆菌侵染液滴在胚性愈伤组织的表面(多余的农杆菌侵染液即由铺在无菌培养皿中的无菌滤纸吸掉)，然后抽真空(0.4～0.6个大气压)处理10min。

实验重复三次，每次重复侵染胚性愈伤组织至少30个。

四、干化处理

完成步骤三后，将胚性愈伤组织移至铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，干化处理1d(目的是使后期愈伤组织不出现水渍化和褐变现象)。

五、共培养

完成步骤四后，将胚性愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的共培养基上共培养3天。共培养条件：25～27℃，暗培养。

六、筛选培养

1、完成步骤五后，将胚性愈伤组织用先灭菌水充分洗涤(即清洗至洗涤后的灭菌水清亮)，然后用含有200mg/L的特美汀和0.02％(体积百分比)Tween20的水溶液洗涤1次，最后置于一次筛选培养基上，光暗交替培养三周，得到抗性愈伤组织。

2、完成步骤1后，将抗性愈伤组织置于二次筛选培养基上，光暗交替培养三周。

3、完成步骤2后，将抗性愈伤组织置于三次筛选培养基上，光暗交替培养三周。

上述光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)的条件均为：25～26℃。光照培养时的光照强度为2000Lx，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

七、分化培养

完成步骤六后，将抗性愈伤组织置于分化培养基乙，光暗交替培养6～8周(分化培养期间每隔3周换一次新的分化培养基乙)，得到分化苗。其中光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)条件为：25～26℃。光照培养时的光照强度为2000Lx，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

八、生根和壮苗筛选培养

完成步骤六后，将分化苗置于生根培养基乙进行光暗交替培养。待根长长至1cm时，剪去根，再置于生根培养基丙进行光暗交替培养，待根长长至3cm以上时(培养时间约为4～7周)即完成再生苗的生根，获得健壮的再生苗，即拟转基因抗性植株。其中光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)条件为：25℃。光照培养时的光照强度为2000Lx，光暗交替培养的周期具体为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。

九、野生型野大麦的获得

取愈伤系S1的野大麦的幼穗，将幼穗剥除外部叶鞘并置于超净工作台，先用70％(体积百分比)的乙醇水溶液擦洗表面，然后用无菌解剖针划开幼嫩的叶鞘，轻轻转动幼穗结节处，抽出被包裹的幼穗并作为外植体，用无菌镊子将该外植体截成0.2cm～0.4cm的节段，接种于诱导培养基上，25℃暗培养4～5周，得到胚性愈伤组织。然后按照实施例1中步骤二至四的方法，获得健壮的再生苗，将该再生苗命名为野生型野大麦(即通过正常再生程序而非通过遗传转化而来的再生苗)。

十、拟转基因抗性植株的检测

1、拟转基因抗性植株的分子检测

分别提取拟转基因抗性植株的叶片和野生型野大麦的叶片的基因组DNA并作为模板，以引物对1进行PCR扩增；用水代替拟转基因抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阴性对照；用质粒pTCK303代替拟转基因抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阳性对照。引物对1由P1：5’-aaggaatcggtcaatacactacatgg-3’和P2：5’-aacagttcctgattaaccacaaacc-3’组成。

分别提取拟转基因抗性植株的叶片和野生型野大麦的叶片基因组DNA并作为模板，以引物对2进行PCR扩增；用水代替拟转基因抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阴性对照；用质粒pTCK303代替拟转基因抗性植株的叶片的基因组DNA，作为阳性对照。引物对2由F1：5’-AAGCCAGACAGAGTGTGATATCT-3’和F2：5’-AACATTACATTGACGCAGGTGAT-3’组成。

实验结果见图2中(a)(上图为用引物对1进行PCR扩增的实验结果，下图为用引物对2进行PCR扩增的实验结果，M为DNA Marker，泳道10至30为以拟转基因抗性植株的叶片的基因组DNA为模板的实验结果，CK为以野生型野大麦的叶片基因组DNA为模板的实验结果，质粒为阳性对照，水为阴性对照)。如果拟转基因抗性植株的基因组DNA用引物对1扩增出约300bp的条带，同时用引物对2扩增出约570bp的条带，则该拟转基因抗性植株即为转基因阳性植株；野生型野大麦和水用引物对1均不能扩增获得300bp条带，用引物对2均不能扩增出570bp条带。结果表明，拟转基因抗性植株中有七株为转基因阳性植株，将其依次命名为OE-1～OE-7。

2、转基因阳性植株的荧光定量PCR检测

采用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN公司产品)提取野生型野大麦、OE-1、OE-2、OE-3、OE-4或OE-5的总RNA并反转录为cDNA，并以此cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测GUS基因的相对表达量(以GAPDH基因为内参基因)。

鉴定GUS基因的引物为GUS-RT-F：5’-CTCCTACCGTACCTCGCATTAC-3’和GUS-RT-R：5’-ACGCGCTATCAGCTCTTTAATC-3’。

鉴定GAPDH基因的引物为GAPDH-RT-F：5’-TTTCGGAAGGATCGGGAG-3’和GAPDH-RT-R：5’-ACAGCCTTGGCAGCACCA-3’。

其中荧光定量PCR反应体系包括10μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司产品)、正反向引物(10μM)各0.8μL，模板cDNA 3μL，ddH₂O 5.4μL。PCR反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。

将野生型野大麦中GUS基因的相对表达量作为1，OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5中GUS基因的相对表达量见图2中(b)(其中WT为野生型野大麦)。OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5中GUS基因的相对表达量分别为野生型野大麦中GUS基因的相对表达量的43倍、32倍、52倍、35倍和94倍。结果表明，GUS基因已成功整合到OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5的基因组中并在转录水平上表达。

3、转基因阳性植株的GUS染色分析

取野生型野大麦、非转基因阳性植株、OE-1、OE-2、OE-3、OE-4或OE-5的叶片，将其充分浸没在GUS反应混和液中，37℃温育过夜，然后依次用50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液和100％乙醇溶液脱色，观察叶片的染色情况。

实验结果见图3((a)中左为OE-4的叶片，右为野生型野大麦的叶片；(b)中左为OE-5的叶片，右为野生型野大麦的叶片；(c)为OE-1的叶片；(d)为OE-2的叶片；(e)为OE-3的叶片；(f)和(g)为非转基因阳性植株的叶片；(h)为转基因阳性植株的叶片(从左到右依次为OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5)；(i)为非转基因阳性植株的叶片)；(k)为转基因阳性植株的叶鞘(从左到右依次为OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5))。结果表明，OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5的叶片和叶鞘经GUS染色后均可着色，且GUS染色强度与步骤2中的GUS基因的相对表达量基本一致。

根据GUS染色结果统计转基因阳性植株的频率，结果表明，按照本发明提供的遗传转化方法获得的转基因阳性植株的频率约为5％。