本发明涉及组织培养，具体地，涉及蓝莓组织培养方法。
背景技术：
：蓝莓(Vacciniumspp.)为杜鹃花科越橘属灌木果树。蓝莓果实被联合国卫生组织列为最佳营养价值的水果，同时被美国评为世界十大健脑食品，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。所以蓝莓的社会需求量日益增长，各国相继引种栽培。2009年以来我国蓝莓产业出现快速发展，目前主要分布于五大区域：长白山及大小兴安岭地区、辽东半岛、胶东半岛、长江流域、云贵川及华南地区。随着栽培面积和产量的不断上升，相关应用研究及应用基础研究越来越受到关注。组织培养在其他园艺作物上开展较多，但在蓝莓上的研究较少，蓝莓的组织培养不易成功，成活率低。技术实现要素：本发明的目的是提供一种蓝莓组织培养方法，解决了用于蓝莓组织培养的培养基中激素配比不明确，用于组织培养的单茎段消毒不合理，进而导致蓝莓组织成活率低，培养不易成功的问题。为了实现上述目的，本发明提供了一种蓝莓组织培养方法，其中，所述蓝莓组织培养方法包括：(1)取当年生的蓝莓嫩枝条，剪取3-4cm带芽茎段；(2)将上述带芽茎段用浓度为70-75体积％的酒精消毒10-30s，再用浓度为0.08-0.12体积％的升汞消毒6-8min，冲洗后备用；(3)将上述带芽茎段切成1-2cm长的带芽的单茎段；(4)将上述单茎段的下端插入初代培养基中进行初代培养；其中，所述初代培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为0.8-1.2mg，所述吲哚丁酸的含量为0.38-0.42mg；(5)将经过初代培养后的单茎段接种到增殖培养基中进行增殖培养；其中，所述增殖培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1.4-1.6mg，所述吲哚丁酸的含量为0.08-0.12mg；(6)将经过增殖培养后的单茎段接种到生根培养基中进行生根培养；其中，所述生根培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的生根培养基，所述玉米素的含量为0-0.1mg，所述吲哚丁酸的含量为0.28-0.32mg；所述初代培养基、增殖培养基、生根培养基为WPM培养基或MS培养基。通过上述技术方案，本发明提供了一种蓝莓组织培养方法，其中，所述蓝莓组织培养方法包括：取当年生的蓝莓嫩枝条，剪取3-4cm带芽茎段，之后将上述带芽茎段用浓度为70-80体积％的酒精消毒10-30s，再用浓度为0.08-0.12体积％的升汞消毒6-10min，冲洗后备用；将上述带芽茎段切成1-2cm长的带芽的单茎段；将上述单茎段的下端插入初代培养基中进行初代培养，之后再经增殖培养和生根培养；通过明确合理设置初代培养基、增殖培养基和生根培养基中激素的含量，以及对单茎段在接种前进行合理的灭菌处理，使得蓝莓的组织培养成活率高，易成功。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了一种蓝莓组织培养方法，其中，所述蓝莓组织培养方法包括：(1)取当年生的蓝莓嫩枝条，剪取3-4cm带芽茎段；(2)将上述带芽茎段用浓度为70-75体积％的酒精消毒10-30s，再用浓度为0.08-0.12体积％的升汞消毒6-8min，冲洗后备用；(3)将上述带芽茎段切成1-2cm长的带芽的单茎段；(4)将上述单茎段的下端(形态学上的下端)插入初代培养基中进行初代培养；其中，所述初代培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为0.8-1.2mg，所述吲哚丁酸的含量为0.38-0.42mg；(5)初代培养后，将经过初代培养后的单茎段接种到增殖培养基中进行增殖培养；其中，所述增殖培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1.4-1.6mg，所述吲哚丁酸的含量为0.08-0.12mg；(6)增殖培养后，将经过增殖培养后的单茎段接种到生根培养基中进行生根培养；其中，所述生根培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的生根培养基，所述玉米素的含量为0-0.1mg，所述吲哚丁酸的含量为0.28-0.32mg；所述初代培养基、增殖培养基、生根培养基为WPM培养基或MS培养基。在上述方法中，步骤(1)中带芽茎段在消毒前可以用少许洗衣粉洗净后进行流水冲洗，冲洗时间为1h以上，同时，上述操作过程都需要在超净工作台上进行，超净工作台使用前用75％的酒精棉将超净工作台内仔细擦拭一遍，把实验用到的酒精棉、升汞酒精、解剖刀、镊子、酒精灯、培养基、无菌水、无菌滤纸等提前放到超净工作台上，打开紫外灭菌灯，灭菌30min；同时，增殖和生根的接种过程不需要外植体的灭菌和消毒，直接在无菌的超净工作台上接种即可。为了进一步提高组织培养的成活率，所述生根培养基为MS培养基，且所述MS培养基包括有硝酸铵、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙；且相对于1L的生根培养基，所述硝酸铵的含量为14-16g，所述硝酸钾的含量为18-20g，所述七水硫酸镁的含量为36-38g，所述磷酸二氢钾的含量为15-18g，所述氯化钙的含量为2-3g；同时，在本发明另一种实施方式中，所述生根培养基为WPM培养基，且所述WPM培养基包括有硫酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸铵和四水硝酸钙；且相对于1L的WPM培养基，所述硫酸钾的含量为9-12g，所述七水硫酸镁的含量为3.6-3.8g，所述磷酸二氢钾的含量为1.6-1.8g，所述硝酸铵的含量为3.8-4.2g，所述四水硝酸钙的含量为27-28g。在本发明的一种优选的方法中，为了使得组织培养能获得充足的光照，合理设置培养条件，所述初代培养、增殖培养和生根培养的培养条件相同，且所述培养条件为：温度为22-28℃，光照时长为12-16h/d，光照强度为1900-2100lx。在本发明的一种优选的实施方式中，为了提高带芽茎段的消毒效果，所述蓝莓组织培养方法还包括：将步骤(2)中所述带芽茎段浸泡于70-80体积％的酒精中震荡消毒10-30s，之后浸泡至0.08-0.12体积％的升汞中震荡消毒6-10min。在本发明的一种优选的实施方式中，为了防止带芽茎段受到二次污染，同时避免带芽茎段在接种前还残留升汞和酒精，步骤(2)中所述冲洗采用灭菌水，冲洗次数为5-6次，且每次冲洗时间为4-5min。在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步避免带芽茎段在接种前还残留升汞和酒精，步骤(3)中还包括将所述单茎段用无菌滤纸将其表面水分吸干。优选的，所述初代培养基、增殖培养基和生根培养基中还含有蔗糖和琼脂，且每种培养基中所述蔗糖的浓度为28-32g/L，所述琼脂的浓度为6-7g/L。在本发明的一种更为优选的实施方式中，为了防止在接种过程中引入新的污染细菌，步骤(4)在酒精灯周围进行。在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高组织培养的成活率，所述初代培养的时间为30天以上，所述增殖培养的时间为30天以上。上述方法的具体操作中，所有用到的东西全部都要放到超净工作台上紫外灭菌，如果条件允许，打开室内的紫外灯，将白大褂、手套、口罩等一起灭菌，灭菌时，将门窗全部关闭，拉上窗帘。操作过程中，操作人员需戴上口罩、手套，穿好白大褂，关闭超净工作台上紫外灯，打开照明灯，把风机调到最大。先用75％的酒精棉把手里里外外擦拭干净，再把超净工作台上重新用75％的酒精棉擦拭干净，打开酒精灯，放到工作台中央，把解剖刀和镊子在酒精灯上里里外外烧三遍，烧红为准，放入染色缸中备用(剖刀和镊子必须彻底灭菌，在酒精灯上来回烧，直到烧红算一次，最少重复三次，同时需要注意的是解剖刀和镊子要不断用火烧，必须等到其冷却后再操作，以防将外植体烫伤)。此外，在上述方法中用到的培养基的配制过程中，琼脂不容易溶解，需要加热，加热时注意不要让琼脂沸出来，调节pH时，温度应控制在50℃以下，温度过高会影响精确度，同时利用温度补偿。分装培养基时，可适当加热后再分装，边搅拌边分装。在灭菌过程中，采用高温灭菌方法，灭菌条件为：温度121℃，压力131kpa，时间23min。灭菌完成后立即关闭电源，打开放气按钮，这样激素不易失活。灭菌完成后将培养基放置2～3天，确保无菌后方可进行实验。上述使用的无菌滤纸：是将滤纸放到培养皿中，用报纸或牛皮纸包好再用皮筋捆好，放到灭菌锅里一同灭菌，之后备用。上述使用的无菌水：是将蒸馏水放到灭菌锅里灭菌即可得到。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例1(1)取当年生的蓝莓嫩枝条，剪取3cm带芽茎段；(2)将上述带芽茎段用浓度为70体积％的酒精消毒10s，再用浓度为0.08体积％的升汞消毒6min，冲洗后备用；(3)将上述带芽茎段切成1cm长的带芽的单茎段；(4)将上述单茎段的下端插入初代培养基(初代培养基为MS培养基)中进行初代培养；其中，所述初代培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为0.8mg，所述吲哚丁酸的含量为0.38mg，初代培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的初代培养基，所述蔗糖的含量为28g，所述琼脂的含量为6g；(5)将经过初代培养后的单茎段接种到增殖培养基(增殖培养基为MS培养基)中进行增殖培养；其中，所述增殖培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1.4mg，所述吲哚丁酸的含量为0.08mg，增殖培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的增殖培养基，所述蔗糖的含量为28g，所述琼脂的含量为6g；(6)将经过增殖培养后的单茎段接种到生根培养基中进行生根培养(生根培养基为MS培养基)；其中，所述生根培养基中还含有吲哚丁酸，且相对于1L的生根培养基，所述吲哚丁酸的含量为0.28mg，生根培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的生根培养基，所述蔗糖的含量为28g，所述琼脂的含量为6g；上述生根培养基中，所述生根培养基为MS培养基，且所述MS培养基包括有硝酸铵、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙；且相对于1L的MS培养基，所述硝酸铵的含量为14g，所述硝酸钾的含量为18g，所述七水硫酸镁的含量为36g，所述磷酸二氢钾的含量为15g，所述氯化钙的含量为2g。实施例2(1)取当年生的蓝莓嫩枝条，剪取4cm带芽茎段；(2)将上述带芽茎段用浓度为75体积％的酒精消毒30s，再用浓度为0.12体积％的升汞消毒8min，冲洗后备用；(3)将上述带芽茎段切成2cm长的带芽的单茎段；(4)将上述单茎段的下端插入初代培养基(初代培养基为MS培养基)中进行初代培养；其中，所述初代培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为1.2mg，所述吲哚丁酸的含量为0.42mg，初代培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的初代培养基，所述蔗糖的含量为32g，所述琼脂的含量为7g；(5)将经过初代培养后的单茎段接种到增殖培养基(增殖培养基为MS培养基)中进行增殖培养；其中，所述增殖培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1.6mg，所述吲哚丁酸的含量为0.12mg，增殖培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的增殖培养基，所述蔗糖的含量为32g，所述琼脂的含量为7g；(6)将经过增殖培养后的单茎段接种到生根培养基中进行生根培养(生根培养基为MS培养基)；其中，所述生根培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的生根培养基，所述玉米素的含量为0.1mg，所述吲哚丁酸的含量为0.32mg，生根培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的生根培养基，所述蔗糖的含量为32g，所述琼脂的含量为7g；上述生根培养基中，所述生根培养基为MS培养基，且所述MS培养基包括有硝酸铵、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙；且相对于1L的MS培养基，所述硝酸铵的含量为16g，所述硝酸钾的含量为20g，所述七水硫酸镁的含量为38g，所述磷酸二氢钾的含量为18g，所述氯化钙的含量为3g。实施例3(1)取当年生的蓝莓嫩枝条，剪取4cm带芽茎段；(2)将上述带芽茎段用浓度为72体积％的酒精消毒20s，再用浓度为0.1体积％的升汞消毒7min，冲洗后备用；(3)将上述带芽茎段切成2cm长的带芽的单茎段；(4)将上述单茎段的下端插入初代培养基(初代培养基为MS培养基)中进行初代培养；其中，所述初代培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为1mg，所述吲哚丁酸的含量为0.4mg，初代培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的初代培养基，所述蔗糖的含量为30g，所述琼脂的含量为6.5g；(5)将经过初代培养后的单茎段接种到增殖培养基(增殖培养基为MS培养基)中进行增殖培养；其中，所述增殖培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1.5mg，所述吲哚丁酸的含量为0.1mg，增殖培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的增殖培养基，所述蔗糖的含量为30g，所述琼脂的含量为6.5g；(6)将经过增殖培养后的单茎段接种到生根培养基中进行生根培养(生根培养基为MS培养基)；其中，所述生根培养基中还含有玉米素和吲哚丁酸，且相对于1L的生根培养基，所述玉米素的含量为0.05mg，所述吲哚丁酸的含量为0.3mg，生根培养基中还加有蔗糖和琼脂，相对于1L的生根培养基，所述蔗糖的含量为30g，所述琼脂的含量为6.5g；上述生根培养基中，所述生根培养基为MS培养基，且所述MS培养基包括有硝酸铵、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙；且相对于1L的生根培养基，所述硝酸铵的含量为15g，所述硝酸钾的含量为19g，所述七水硫酸镁的含量为37g，所述磷酸二氢钾的含量为17g，所述氯化钙的含量为2.5g。实施例4按照实施例3的方法进行，不同的是，初代培养基、增殖培养基、生根培养基为WPM培养基，其中，生根培养基中包括有硫酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸铵和四水硝酸钙；且相对于1L的生根培养基，所述硫酸钾的含量为10g，所述七水硫酸镁的含量为3.7g，所述磷酸二氢钾的含量为1.7g，所述硝酸铵的含量为4g，所述四水硝酸钙的含量为27.5g。对比例1按照实施例3的方法进行，不同的是，将上述带芽茎段用浓度为60体积％的酒精消毒5s，再用浓度为0.05体积％的升汞消毒5min，冲洗后备用。对比例2按照实施例3的方法进行，不同的是，将上述带芽茎段用浓度为90体积％的酒精消毒40s，再用浓度为0.15体积％的升汞消毒12min，冲洗后备用。对比例3按照实施例3的方法进行，不同的是，初代培养基、增殖培养基和生根培养基中不添加玉米素和吲哚丁酸。对比例4按照实施例3的方法进行，不同的是，初代培养基中，相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为0.5mg，所述吲哚丁酸的含量为0.3mg；生根培养基中，相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1mg，所述吲哚丁酸的含量为0.05mg；在生根培养基中，且相对于1L的生根培养基，所述玉米素的含量为0.1mg，所述吲哚丁酸的含量为0.25mg。对比例5按照实施例3的方法进行，不同的是，初代培养基中，相对于1L的初代培养基，所述玉米素的含量为1.5mg，所述吲哚丁酸的含量为0.45mg；生根培养基中，相对于1L的增殖培养基，所述玉米素的含量为1.8mg，所述吲哚丁酸的含量为0.15mg；在生根培养基中，且相对于1L的生根培养基，所述玉米素的含量为0.12mg，所述吲哚丁酸的含量为0.35mg。表1实施例编号增殖培养20天后单茎段的长势情况实施例1长势较好，出现较多的枝叶实施例2长势较好，出现较多的枝叶实施例3长势较好，出现较多的枝叶实施例4长势较好，出现较多的枝叶对比例1长势较差，出现的枝叶较为稀疏对比例2长势较差，出现的枝叶较为稀疏对比例3长势较差，出现的枝叶较为稀疏对比例4长势较差，出现的枝叶较为稀疏对比例5长势较差，出现的枝叶较为稀疏通过上述表格可以看出，利用本发明范围内的方法进行培养，增殖培养20天后，长势较好，出现较多的枝叶，而利用本发明范围外的方法进行培养，增殖培养20天后，长势较差，出现的枝叶较为稀疏，本发明通过明确合理设置初代培养基、增殖培养基和生根培养基中激素的含量，以及对单茎段在接种前进行合理的灭菌处理，使得蓝莓的组织培养成活率高，易成功。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 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