本发明属于农业生物防治与微生物制剂应用
技术领域：
，具体涉及一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂及其制备方法。
背景技术：
：油菜是我国重要的油料作物，由核盘菌引起的油菜菌核病是世界范围内的一种重要病害，在我国发生普遍且危害严重，一般年份发病率为10%-30%，严重年份或严重地块的发病率达80%以上，导致严重减产和品质下降。由于核盘菌具有：（1)可以在土壤中顽固存活，而且极易在土壤中积累；(2)寄主范围极广；(3)菌核在条件适宜时可以萌发形成菌丝体，菌丝体或侵染苗期作物或利用土壤中的营养进行生长，并形成更多的菌核，一个菌核可以产生很多子囊盘，在春季田间菌核萌发持续时间长达50d等特点，因此在生产上采取推广抗(耐)作物品种、农业防治和化学防治的措施。推广抗病品种是植物病害防治中最为经济有效的措施之一，但是油菜对菌核病不表现垂直杭性，目前还没有有效的抗病品种问世。因此，长期以来，对该病的防治主要采取花期对地上部部喷施化学药剂，但防治效果并不稳定。除此之外，长期大量使用农药，存在严重的遗留问题：第一，在核盘菌群体中出现了抗药性菌株，如潘以楼(1998)报道核盘菌群体中己出现了对多菌灵高抗的菌株；第二，污染环境和为害人类健康。鉴于上述原因，20世纪80年代以来人们逐渐把目光投向了生物防治.目前，油菜菌核病的生物防治以活体微生物或其代谢产物控制核盘菌的研究较多，己有的研究结果表明，许多土壤、叶围、根围及内生微生物甚至包括一些植物病原物对核盘菌均有一定程度的抑制作用。据报道现在己知有30多种以上的真菌、细菌或其它微生物对核盘菌具有寄生或拮抗作用，己发现对核盘菌具有拮抗作用的微生物包括：青霉、鸟巢菌、假单胞杆菌、芽抱杆菌、毛霉、轮枝菌、笋顶孢、单孢枝霉、淡紫拟青霉、紫色附球菌等。重寄生真菌包括:盾壳霉、木霉、粘帚霉、食菌核甚孢霉、和黄色蠕形霉等等。对该病害生物防治的多数研究主要集中在木霉、粘帚霉、盾壳霉等属的一些真菌种类，如罗宽等研究了南方油菜土壤中油菜菌核病菌菌核上的寄生真菌，发现木霉菌为优势种群，且绿色木霉Tv36等菌株在室内对菌核有90%以上的寄生腐烂。廖晓兰等报道了将木霉制剂施于油菜地，田间可减轻病害50%左右。也有报道用粘帚霉处理土壤后产生的菌核数比自然土壤少，并且测定了木霉、粘帚霉、盾壳霉及2个镰刀菌菌株对核盘菌菌丝体、子囊饱子产生以及菌核产生数量的影响，发现盾壳霉、绿粘帚霉、哈茨木霉完全能控制核盘菌产生子囊盘，而粉红枯帚霉对其只起轻微作用。此外，皿内和田间试验结果表明，细菌对油菜菌核病也具有一定的抑制作用和防治效果。李国庆自腐烂菌核和油菜等七种植物地上部分健康组织表面分离到31株对油菜菌核病菌有抑制作用的细菌菌株。廖晓兰于油菜初花期和盛花期从花瓣和花药上分离并筛选到6株对核盘菌有抑制作用的拮抗细菌，初步鉴定为芽孢杆菌。陈士云等从土壤中分离到一株解淀粉芽孢杆菌，能够抑制油菜核盘菌菌核形成。吴健胜等筛选到1株对草酸具有很强解毒活性的菌株，能够防治油菜菌核病。综上所述，对于油菜菌核病生物防治的研究报道很多，但是从研究现状来看依然存在一些问题。如，在所报道的大最生防菌中，大部分研究内容仅限于皿内试验、活体生测及少量的小区防病试验，研究结果仍然停留在实验室阶段，很少有关于将其广泛应用于田间大面积病害防治的报道；对于利用生防细菌防治该病害的研究主要为单一菌株的防治试验，但是，由于病原菌的多样性和同步进化特性，现有的单一拮抗菌株由于其作用方式单一、防治效果不稳定、生产和使用也无法达到很理想的防治效果，因此，生防菌的很多生物功能需要依靠两株或两株以上的细菌间的协同作用，才能发挥出更好的作用。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂。该复合微生物制剂的原料配比为：拒霉素链霉菌发酵液20-40份，不枝链霉菌发酵液10-30份，特基拉芽孢杆菌发酵液20-40份，西姆芽孢杆菌发酵液10-30份，子座木霉发酵液20-40份。在所述微生物制剂中的拒霉素链霉菌，不枝链霉菌，特基拉芽孢杆菌，西姆芽孢杆菌，子座木霉等5种菌是从400多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能产生多种抗菌素如拒霉素，醋霉素和大环内酯菌素，能对油菜菌核病病原菌--核盘菌产生超强抑制效果，从而达到超强防治油菜菌核病的作用；另一方面，本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，以及通过次级代谢产物诱导油菜产生抗病性，增强其防病效果；再次，本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果；本发明的第二目的在于提供一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂的制备方法，该方法步骤简单，确保微生物制剂的药肥效果突出。为了达到上述目的，该防治油菜菌核病的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：拒霉素链霉菌发酵液的制备取出拒霉素链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为拒霉素链霉菌种子液；发酵：将上述制备的拒霉素链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的拒霉素链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到拒霉素链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的拒霉素链霉菌发酵培养基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二：不枝链霉菌发酵液的制备取出不枝链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为不枝链霉菌种子液；发酵：将上述制备的不枝链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的不枝链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到不枝链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的不枝链霉菌发酵培养基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三，特基拉芽孢杆菌发酵液的制备取出特基拉芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L特基拉芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于40亿cfu/ml，即可作为特基拉芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0，NaCl10.0g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述特基拉芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25g/L，花生粕粉30g/L，玉米浆干粉5g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四，西姆芽孢杆菌发酵液的制备取出西姆芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L西姆芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为300L/min，30℃培养24-36小时，待总芽孢含量不低于80亿cfu/ml，即可作为西姆芽孢杆菌发酵液；其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述西姆芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉20g/L，菜粕粉30g/L，鱼粉10g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五，子座木霉发酵液的制备取出子座木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为子座木霉种子液；发酵：将上述制备的子座木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L子座木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min，24小时后通气量为360L/min，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到100g/L，即可停罐，即可作为子座木霉发酵液；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的子座木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤六，混合发酵液将前五个步骤制备的菌液按拒霉素链霉菌发酵液20-40份，不枝链霉菌发酵液10-30份，特基拉芽孢杆菌发酵液20-40份，西姆芽孢杆菌发酵液10-30份，子座木霉发酵液20-40份，混匀，即得到防治油菜菌核病的复合微生物制剂。其中，该复合微生物制剂在防治油菜菌核病的方法为在油菜初花期与盛花期各喷施一次，每次叶面喷施用量为1-2L/亩，其稀释的倍数为100-200倍。本发明具有的优点和有益效果：、本发明中包含的拒霉素链霉菌，不枝链霉菌，特基拉芽孢杆菌，西姆芽孢杆菌，子座木霉等5种菌是从400多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能在植株的根，茎，叶以及土壤中能够生长繁殖，能产生多种抗菌素如拒霉素，醋霉素和大环内酯菌素；它们对抑制油菜菌核病病原菌--核盘菌有特别强大的效果，从而达到超强防治油菜菌核病的效果，其对油菜菌核病的药效高，平均防效在90.83%以上，且针对性强；、本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过次级代谢产物诱导油菜产生抗病性，增强其防病效果；、本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果；(4)、本发明复合微生物制剂对人、畜安全，属于环境友好型，利用本发明方法防治油菜菌核病不易产生抗药性，本发明制备方法稳定、菌种多，相对于单一拮抗菌，产生的拮抗物质广泛，效果显著，成本低、使用简单。具体实施方式实施例1一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂的原料配比为：拒霉素链霉菌发酵液30份，不枝链霉菌发酵液20份，特基拉芽孢杆菌发酵液30份，西姆芽孢杆菌发酵液20份，子座木霉发酵液30份。该防治油菜菌核病的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：拒霉素链霉菌发酵液的制备取出拒霉素链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为拒霉素链霉菌种子液；发酵：将上述制备的拒霉素链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的拒霉素链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，开搅拌200r/min，培养44小时，检测其菌体含量为65g/L，停罐，即得到拒霉素链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的拒霉素链霉菌发酵培养基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二：不枝链霉菌发酵液的制备取出不枝链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为不枝链霉菌种子液；发酵：将上述制备的不枝链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的不枝链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养42小时，检测其菌体含量为82g/L，停罐，即得到不枝链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的不枝链霉菌发酵培养基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三，特基拉芽孢杆菌发酵液的制备取出特基拉芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L特基拉芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30℃培养32小时，检测其总芽孢含量为42亿cfu/ml，即可作为特基拉芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述特基拉芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25g/L，花生粕粉30g/L，玉米浆干粉5g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四，西姆芽孢杆菌发酵液的制备取出西姆芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L西姆芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为300L/min，30℃培养28小时，检测其总芽孢含量为83亿cfu/ml，即可作为西姆芽孢杆菌发酵液；其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述西姆芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉20g/L，菜粕粉30g/L，鱼粉10g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五、子座木霉发酵液的制备取出子座木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为子座木霉种子液；发酵：将上述制备的子座木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L子座木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min，24小时后通气量为360L/min，30℃培养39小时，检测其菌体含量为108g/L，停罐，即可作为子座木霉发酵液；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的子座木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤六、混合发酵液将前五个步骤制备的菌液按拒霉素链霉菌发酵液30份，不枝链霉菌发酵液20份，特基拉芽孢杆菌发酵液30份，西姆芽孢杆菌发酵液20份，子座木霉发酵液30份，混匀，即得到防治油菜菌核病的复合微生物制剂。实施例2复合微生物制剂抑菌活性检测试验将实施例1制备的微生物制剂稀释100倍和200倍，采用平板对峙法检测两种微生物制剂对油菜菌核病菌菌丝生长的影响。于PDA平板中央放置牛津杯，其中滴加微生物制剂稀释液各100uL，四周对称位置放置培养2d的油菜菌核病菌菌饼(直径为5mm)。以滴加清水的处理作为对照，每个处理设置三次重复。于25℃恒温培养5d后，观察微生物制剂对菌丝生长的抑制情况，测量抑菌圈直径。试验结果：将本发明复合微生物制剂稀释200倍后，可以显著抑制油菜菌核病菌的生长，抑菌圈直径可达20mm以上。将本发明复合微生物制剂稀释100倍后，可以显著抑制油菜菌核病菌的生长，抑菌圈直径可达25mm以上。实施例3本发明复合微生物制剂防治油菜菌核病的田间试验试验设在湖南省隆回县滩头镇大底村某种植户，经调查该地块多年发生油菜菌核病，并且喷施之前调查已经在田埂上发现子囊盘。设置初花期喷施一次、盛花期喷施一次和初花期和盛花期各喷施一次3个不同的处理，于2015年3月中旬油菜的初花期将实施例1制备的本发明复合微生物制剂稀释200倍均匀喷施于油菜花朵及叶片上，用量复合微生物制剂1L/亩，l0d后盛花期喷施第二次，每个小区66.7m2，每个处理3个重复，以喷施多菌灵50%可湿性粉剂500倍稀释液作为对照。于收获初期调查植株发病情况，五点取样，记录发病株数及病害严重度，计算防治效果；病情指数=[Σ(各级病株数×代表数值)/(调查总株数×发病最重级的代表数值)〕×100防治效果(%)=[(对照组病情指数一处理组病情指数)/对照组病情指数]×100试验结果如表1，将本发明的复合微生物制剂稀释200倍以后，在初花期和盛花期各喷施一次的防治效果最好，防治效果达到90.83%，于初花期喷施一次的防治效果和盛花期喷施一次的防治效果也达到了75.35%以上。表1复合微生物制剂对油菜菌核病的田间防治效果处理病株率（%）病情指数防治效果（%）产量（kg）增产率（%）初花期一次2.091.0385.2426.826.42盛花期一次2.961.7275.3524.616.04初花+盛花期1.780.6490.8328.433.96对照组9.676.9821.2当前第1页1 2 3