兜兰新品种“优优兜兰”组培快繁方法与流程

本发明涉及生物工程的植物组织培养繁育方法，特别是涉及一种兜兰新品种“优优兜兰”的组培快繁方法。

背景技术：

兰科植物是自然界最大的家族之一，是有花植物中最为庞大和进化水平极高的类群之一，在被子植物当中仅次于菊科和禾本科位于第三大科。全世界的兰科植物约有700属，20000-30000种，广泛分布于从温带、亚热带到热带的广大区域。我国已发现并定名的兰花约170余属1300余种，其中2/3为附生兰，1/3为地生兰。目前，整个兰科植物已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录ⅰ或ⅱ。贵州是一个喀斯特地貌广泛发育的高原省份，在地理环境上属于亚热带气候，具有独特复杂的地形地貌、植被类型多样和良好的水热条件，适宜多种植物繁衍生息，同时也孕育了较丰富的兰花资源。贵州省境内分布有兰科植物约76属320余种，包括大量的变种及品种。

兜兰属（paphiopedilumpfitz）植物是兰科植物最具观赏价值的物种之一，兜兰由于独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，全世界广泛栽培。中国是兜兰属植物的主要产地之一，是世界兜兰属的重要分布地和许多新种的模式产地，有18种（chen，1999）。自20世纪80年代初，我国的兜兰属植物开始出现在欧美市场；80年代末至90年代中期是我国野生兜兰属植物贸易的高峰，兜兰市场迅速扩大，不计其数的植株出现在一些欧美种植场和花卉市场。

兜兰新品种“优优”（paphiopedilumgzslkyyouyou），于2016年08月17日在英国皇家园艺学会（royalhorticulturalsociety简称rhs）登陆，并获得了兰花新品种登记证书。英国皇家园艺学会是世界上唯一的、权威的兰花新品种登录机构，该机构只登录首次育成的兰花属间和种间杂交种。“优优兜兰”是以长瓣兜兰（paphiopedilumdianthum）为母本，小叶兜兰（paphiopedilumbarbigerum）为父本，进行杂交育种方法选育而成，

由于“优优兜兰”胚发育不完全，在自然状态下繁殖困难，存在种子萌发率极低，成苗率低，生长速度慢等缺点；传统的无性分株繁殖法，周期长，繁殖系数低，每年只能增殖1～3倍，常规繁殖难度大。因此如何运用植物生物促成方法快速繁殖“优优兜兰”已成为兰科植物保育及应用的重点课题。

兜兰属的杂交育种由于受种子萌发条件的限制，发展很缓慢，自从兰科植物无菌播种技术应用后，兜兰属植物杂交育种得到了快速发展。但“优优兜兰”属于兰科、兜兰属植物的新品种，其组培快繁方法尚处于摸索、处理阶段，“优优兜兰”种子极其微小，采用其它兜兰属的成熟的组培快繁育苗方法，导致败育率极高，甚至出现完全败育的状态。而兰花的培育周期又长，仅杂交、育苗期动辄就要1-3年。

所以研究一种败育率低、采用组培快繁方法、可实现批量工厂化育苗方法，就成为“优优兜兰”快速走向市场、满足人们需求的重要前提条件。

技术实现要素：

为解决现有技术中“优优兜兰”因胚发育不完全，在自然状态下繁殖困难的技术问题，本发明提供一种败育率低，可以极大的提高繁殖系数的高效率试管繁殖方法，即兜兰新品种“优优兜兰”组培快繁方法。

兜兰新品种“优优兜兰”组培快繁方法，包括以下步骤：

a、人工杂交授粉：以长瓣兜兰为母本，小叶兜兰为父本，选取生长健壮的长瓣兜兰母本及父本在开花时开展人工辅助授粉，授粉后370到390天，将发育至基本成熟而未开裂的果实作为外植体；

b、无菌播种及原球茎萌发阶段：选用饱满的果实用酒精浸泡，置于升汞溶液中消毒，无菌水冲洗，用解剖刀切开果实，用接种针将褐色粉末种子接种到培养基上，培养80-100天，形成原球茎及芽混合体；

c、增殖分化培养阶段：为获得更多的种苗，将芽和原球茎混合组织接种在1/2ms添加6-苄基氨基嘌呤(6-ba)、α-萘乙酸（naa）培养基上，经140-160天培养，长成丛生带短根的小苗；

d、壮苗生根阶段：将长成的丛生植株分开，接种到1/4ms添加α-萘乙酸（naa）的培养基上，直到长成具2-3条根、3-4片叶的完整植株。

e、炼苗及移栽：当试管苗长至3-4厘米时出瓶，出瓶前在温室中的自然光照下炼苗，然后将其从玻璃瓶中取出，移入碎树皮和腐殖土的混合基质中；加强温度、温度、遮阴及通风管理，“优优兜兰”即可正常生长，成苗的移栽成活率可达90％以上；定期浇一次含氮、磷、钾的复合肥，薄肥勤施，栽培中加强病虫害管护措施即可建立兜兰新品种“优优兜兰”种苗的产业化培育方法体系。

本发明的有益效果是：“优优兜兰”综合了双亲的优良性状，具有株型紧凑，花形独特典雅，花色绚烂靓丽，易于栽培，平均花期可达50天，其保持了母本的多花特性和父本的短花葶特性，避免了花数单一和花葶过长易倒伏和折断的缺点，具有极高的观赏价值。种子萌发率和开花率高，栽培周期为3-4年，是兜兰新品中极具观赏价值的珍品，本发明通过兜兰新品种“优优兜兰”的组培繁殖方法研究，可以提高繁殖系数，是获得大量“优优兜兰”种苗的高效率试管繁殖方法，具有萌发率高，成苗快，种苗品质好、生长势强等优势，能够得到整齐化一的试管苗，并在短时间内提供大量的种苗，为“优优兜兰”的种苗生产提供一条有效的途径，从而更好的保护野生资源。

附图说明

本发明的附图说明如下：

图1：兜兰新品种“优优兜兰”开花图片；

图2：兜兰新品种“优优兜兰”栽培图片。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的说明：

兜兰新品种“优优兜兰”组培快繁方法，包括以下步骤：

a、人工杂交授粉：以长瓣兜兰为母本，小叶兜兰为父本，选取生长健壮的长瓣兜兰母本及父本在开花时开展人工辅助授粉，授粉后370到390天，将发育至基本成熟而未开裂的果实作为外植体；

b、无菌播种及原球茎萌发阶段：选用饱满的果实用酒精浸泡，置于的升汞溶液中消毒，无菌水冲洗，用解剖刀切开果实，用接种针将褐色粉末种子接种到培养基上，培养80-100天，形成原球茎及芽混合体；

c、增殖分化培养阶段：为获得更多的种苗，将芽和原球茎混合组织接种在1/2ms添加6-苄基氨基嘌呤(6-ba)、α-萘乙酸（naa）培养基上，经140-160天培养，长成丛生带短根的小苗；

d、壮苗生根阶段：将长成的丛生植株分开，接种到1/4ms添加α-萘乙酸（naa）的培养基上，直到长成具2-3条根、3-4片叶的完整植株；

e、炼苗及移栽：当试管苗长至3-4厘米时出瓶，出瓶前在温室中的自然光照下炼苗，然后将其从玻璃瓶中取出，移入碎树皮和腐殖土的混合基质中；加强温度、温度、遮阴及通风管理，“优优兜兰”即可正常生长，成苗的移栽成活率可达90％以上；定期浇一次含氮、磷、钾的复合肥，薄肥勤施，栽培中加强病虫害管护措施即可建立兜兰新品种“优优兜兰”种苗的产业化培育方法体系。

进一步的，获取“优优兜兰”的组培苗，父本和母本之间的杂交过程是实现以下三个问题的至关重要的步骤：1、获得的种子是否为“优优兜兰”新品种；2、杂交获取的种子是否可以培育出“优优兜兰”；3、培育出的“优优兜兰”是否达到品质要求。具体的做法为：8月初兜兰开花季节，人工控制调节父母本的开花状况，母本长瓣兜兰花苞快张开时，喷洒一次浓度为1000ppm的乙烯利来促进长瓣兜兰开花，一周后再用同样的方法促进小叶兜兰开花，以长瓣兜兰开花开始计算时间两周后再进行人工辅助授粉，这时长瓣兜兰柱头分泌大量粘液，小叶兜兰花粉具活力，杂交亲和力强，效果最佳，果实饱满，种子组培后成活率高。通过此方法，获得“优优兜兰”种子的坐果率提高到95%以上，母本、父本的花期的上述选择是提高坐果率的决定性因素。（由于缺乏有效传粉昆虫，自然条件下坐果率仅为20%），而且果实饱满，种子组培后成苗率高。

进一步的，步骤b中，所述的用酒精浸泡时，选用75％的酒精，浸泡时间为5min；升汞溶液中消毒指0.1％的升汞溶液，浸泡10min；所述的无菌水为蒸馏水或肥皂水。

进一步的，步骤b中，所述的培养基是指1/2ms添加6-苄基氨基嘌呤(6-ba)0.5-1.0毫克/升、α-萘乙酸（naa0.1-0.2毫克/升培养基。培养基是组培苗能够形成和生长的极其重要的因素。而6-苄基氨基嘌呤、α-萘乙酸的上述配方和浓度更是决定组培苗成功与否的关键。

进一步的，步骤b中，无菌播种及原球茎萌发阶段培养90天时进行下一步骤，败育率最低。

进一步的，步骤c中培养基配方中，6-苄基氨基嘌呤(6-ba)浓度为2-4毫克/升，α-萘乙酸（naa）浓度为0.1-0.5毫克/升，培养时间为150天为佳。

进一步的，步骤d中，丛生植株分开后接种到1/4ms添加α-萘乙酸（naa）0.1-0.5毫克/升的培养基上，培养55-65天后长成具2-3条根、3-4片叶的完整植株。

进一步的，步骤e中，当试管苗长至3-4厘米时，出瓶前在温室中的自然光照下炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入碎树皮和腐殖土为4:1的混合基质中。温室保持15-28℃的温度、80%以上的湿度、70-80%的遮阴并通风，“优优兜兰”即可正常生长，成苗的移栽成活率可达90％以上。通常15天左右浇一次氮：磷：钾的比例为14：16；15的复合肥1000倍，薄肥勤施，栽培中加强病虫害管护措施。

本发明的保护范围不仅限于具体实施方式所公开的技术方案，凡本专利申请中各技术方案的步骤，对“优优兜兰”进行组培快繁的方法，以及在上述技术方案的基础上进行的改进、等同替换，均落入本发明的保护范围。