贝莱斯芽孢杆菌在促进大蒜生长中的应用的制作方法

本发明涉及生物防治与生物农药，尤其涉及贝莱斯芽孢杆菌在促进大蒜生长中的应用。

背景技术：

大蒜(alliumsativuml.)是百合科葱属作物，其以鳞茎(蒜头)、蒜薹和幼株为产品，营养丰富，是最受欢迎的传统调制品和重要的保健食品之一。我国是大蒜的主要生产国，大蒜种植面积逐年扩大，开发新型的植物生长促进剂是解决大蒜施肥问题的新方向。植物内生菌由于能够产生丰富多样的代谢产物，是应用前景广阔的资源微生物，其在自然界中的重要的生态学作用，引起了人们的广泛关注。植物内生菌因与植物共生，其对植物生长及植物周围的微环境有调节和修复的作用。芽孢杆菌(bacillusspp.)是应用较多的生防细菌之一，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，所以是理想的生防菌筛选对象。常用植物生长促进剂如赤霉素(ga)、萘乙酸(naa)、复硝酚钠等都是通过化学合成的方法产生的，合成成本高，操作复杂，而利用植物内生菌不仅培养简单，成本低，而且效果好。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的问题，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(bacillussubtilis)在促进大蒜生长中的应用，在大蒜鳞茎生长至6叶时，将所述贝莱斯芽孢杆菌的菌液喷洒在大蒜植株茎基部以促进大蒜生长，此构成本发明的第一个方面。

本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌在制备大蒜生长促进剂中的应用，包括作为活性成分的贝莱斯芽孢杆菌和载体，所述生长促进剂为促进大蒜植株高度的促进剂。此外，所述生物促进剂还包括复配剂，所述复配剂为赤霉素(ga)、萘乙酸(naa)、复硝酚钠中的至少一种，此构成本发明的第二个方面。

本发明的有益效果：以贝莱斯芽孢杆菌促进大蒜生长，无农药残留，无环境污染，不对人畜造成安全威胁；以贝莱斯芽孢杆菌的发酵液制备的大蒜生长促进剂，制备过程简单，成本低，效果好，使用方便。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌为bacillussubtilisstrainnds11，文献出处：李乐溪等.大蒜内生菌的分离及拮抗菌株的筛选与鉴定[j].江苏农业科学，2018，46(5)：97-101.贝莱斯芽孢杆菌bacillussubtilisstrainnds11可从江苏省徐州市沛县种植的大蒜磷茎中通过常规方法分离筛选而获得，也可联系本申请人索取。申请人声明从本申请申请日起二十年内，公众可联系申请人索取该菌种。

附图说明

图1为本发明实施例1所述的菌株125的16srrna基因系统发育树；

图2为本发明实施例2中所述的菌株125在体外产生长素(iaa)的照片；其中，左图为125产iaa的照片，右图为lb空白对照；

图3为本发明实施例3中所述的在温室中菌株125对大蒜生长促进的照片，其中，左图为未接菌株125菌液的对照，右图为接种菌株125菌液的处理。

具体实施方式：

实施例1：菌株分离与鉴定

在江苏省徐州市沛县采集健康的大蒜磷茎，通过常规方法提取内生菌，并分离纯化，获得一株纯菌株编号为125。使用lb液体培养基于37℃、200rpm摇瓶培养24h，之后以8000rpm离心收集菌体，再通过微波法提取菌体基因组dna，最后用细菌通用引物27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'(序列2)和1492r：5'-aaggaggtgatccagccgca-3'(序列3)进行16srdnna基因pcr扩增。pcr反应体系为：10×buffermix(包含taq酶)12.5μl，10μmol/l27f0.5μl，10μmol/l1492r0.5μl，ddh2o10.5μl，模板dna1μl，pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工有限公司测序，结果如seqidno.1所示。采用mega5软件构建系统发育树如图1所示，表明菌株125应为bacillussubtilis中的一员。在ncbi以及ezbiocloud网站上比对测序结果，比对结果如表1所示，该菌株与贝莱斯芽孢杆菌bacillussubtilisstrainnds11菌株的相似性为100％。

表1编号125菌株的序列比对结果

实施例2：菌株125在体外产生促进植物生长物质的测定

菌株125在20mlsms液体培养基中摇培，转速200rpm，温度37℃。4天后，加入0.5mg/ml的色氨酸，室温放置。然后吸取1ml细胞悬浮液到新的离心管中加入2ml显色剂，然后室温黑暗静置20min，对照为不接125菌株的lb液体培养基，如果与对照相比，接菌处理出现粉红色则表明125菌株产生了iaa(图2)，如果没出现则表示125不能产生iaa。sms培养基配方如下：1l:蔗糖10.0g，(nh4)2so41.0g，k2hpo42.0g；mgso40.5g；nacl0.1g；酵母浸提物0.5g；caco30.5g；ph7.2.显色剂(现配现用)配制方法：在通风橱内取15ml的浓硫酸和25ml的去离子水，将浓硫酸缓慢加入去离子水中，同时用玻璃棒迅速搅拌(混匀、散热)；待硫酸溶液冷至室温后，再加0.5mol/l的氯化铁溶液750μl，混匀后待用，即为salkowski’s显色剂。

配制无机磷测试培养基，用灭菌牙签将125单菌落点接与培养基中心，30℃倒置培养，3天后观察细菌四周能否产生透明圈，如果有则说明该菌株具有解无机磷活性，记录溶磷圈直径与菌落直径，二者的比值反应解无机磷活性的强弱，如果菌落四周不能产生透明圈，则表明该菌无解无机磷活性(表2)。无机磷测试培养基配方如下：葡萄糖10.0g，硫酸镁0.25g，磷酸钙5.0g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，葡萄糖10.0g，氯化镁5.0g，琼脂粉20.0g。

表2125菌株产生促生物质的能力

实施例3：菌株125促进大蒜生长效果测试

将37℃液体lb摇培16h的125菌液用无菌水洗3次，最终用无菌水将菌液稀释到10⁸个细胞/ml，以供内生菌处理用。在21×20×15cm³的花盆中播种大蒜品种“改良”的磷茎，25℃光照16h/黑暗8h培养20-25天，进入大蒜花芽磷芽分化期(6叶期)。取17ml125菌株的菌液，沿着大蒜植株茎基部喷涂一圈，然后覆上土，25℃黑暗保湿24h，然后25℃光照16h/黑暗8h培养15天。空白对照不接内生菌。每个处理4盆，总共重复了3次试验。接菌后的第15天分别统计对照和处理的整株植株高度、地上部分植株高度、根长、地上部分鲜重、根鲜重和整株植株鲜重。如图3所示，用菌株125的菌液处理过的大蒜植株与对照相比，长势茂盛，并且叶片宽阔，表明菌株125对大蒜的促进生长效果显著。

由于贝莱斯芽孢杆菌与大蒜的共生关系，贝莱斯芽孢杆菌对大蒜的健康生长是有利的，因此，从大蒜中分离内生菌进行富集后在喷施在大蒜上可以促进大蒜的生长。贝莱斯芽孢杆菌可与非离子表面活性剂，如吐温、脂肪胺、甘油脂肪酸酯类混合，以水为介质，超微粉碎制成粘稠状可流动的悬浮液，喷洒于作物表面，可吸附于微粒表面形成不同的分散体系，改善植物茎基部生物农药的分布和渗透，提高利用率。其次，也可与惰性填料和一定量的分散剂，按比例经充分混匀后，达到一定粉粒细度。这些粉状农药可以直接施于植物茎基部，被吸收，也可加水湿润、分散，喷洒施用。粉状农药具有储运方便、安全的特点，包装材料容易处理，对植物也较安全。再次，也可以与赤霉素、萘乙酸或复硝酚钠等混合配制以增进效果。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>贝莱斯芽孢杆菌在促进大蒜生长中的应用

<160>3

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<211>1379

<212>dna

<213>贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)

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