叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒及使用方法与流程

本发明属于害虫敏感性快速检测技术领域，尤其涉及一种叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

目前，最接近的现有技术：

朱砂叶螨(tetranychuscinnabarinus)(boisduval)属真螨目，叶螨科，又名棉红蜘蛛、红叶螨，以成螨在叶背吸取汁液为害，叶片受害后，叶面呈现灰白色或形成枯黄色细斑，盛发期在茎、叶上形成一层薄丝网，使植株生长不良，严重时导致整株死亡。朱砂叶螨是我国分布最广、发生最严重的一种农业植食性害螨，在各地严重危害棉花、小麦、杂粮、蔬菜、瓜果以及林木等32科共113种植物。为有效控制朱砂叶螨的田间危害，需要明确其对常用药剂的敏感性，以便于科学选药和用药。

传统的生测方法包括玻片浸渍法、药膜法、直接喷雾法、点滴法、“三明治”法等，目前常用点滴和药膜法来测定室内和田间品系分别对药剂的致死中量(ld50)，并以此来确定病虫害田间种群的敏感度，以达到科学选药和用药的目的。但是，由于这些方法对专业技术的要求较高，实验耗费的时间也较长，且对于防治朱砂叶螨、二斑叶螨、苹果、柑橘全爪螨、棉叶螨等微小型害虫来说，收集工作的难度过大，且也受作物株高等一系列自然因素的影响，在生产实践上不便于操作，而短期内无法观察到实验结果，不能及时地为田间科学用药提供依据。

目前，诊断剂量法以简便、易操作的特点，成为室内实验敏感性检测的一种主要方法。此前，小菜蛾、黄曲条跳甲、盲蝽、棉蚜、马铃薯甲虫、棉铃虫等害虫田间敏感性成功检测的实例也在一定程度上验证了该方法的可信度。诊断剂量一般都要求以敏感基线的ld99或ld99.9作为诊断剂量。这就要求用害虫的敏感品系来测定。但绝大多数害虫的敏感品系都很难获得及培育，使改方法仅局限于室内的检测，在田间较难应用。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有方法对专业技术的要求较高，实验耗费时间长，收集工作难度大，在生产实践上不便于操作，而短期内无法观察到实验结果，不能及时地为田间科学用药提供依据。

解决上述技术问题的难度：基层科技人员或农民在一定时间内无法达到对专业技术和操作上的高要求，且田间试验无法满足显微镜等较大型仪器的使用，传统的收集方法也不能达到快速而准确的标准。

解决上述技术问题的意义：可供基层科技人员或农民直接使用，在一定程度上及时便捷地了解到田间微小型害虫的抗药性情况，为指导田间科学用药提供简便快捷的用具和方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒及使用方法。

本发明是这样实现的，一种叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒及使用方法。所述叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的制作方法包括：

步骤一，室内药膜法生测获得朱砂叶螨敏感品系对甲氰菊酯及丁氟螨酯的4小时敏感基线(lc-p线)，计算获得诊断剂量(lc99)；并检索两种杀螨剂的田间推荐使用浓度(frc)；

步骤二，制作两种药剂，各三种浓度诊断药瓶(指型管)：lc99，2×lc99，frc；挑入30头左右朱砂叶螨，4小时后检测死亡率情况；

步骤三，室外网室饲养四种朱砂叶螨种群，使用田间推荐剂量处理各种群，药后1天，10天，15天调查田间防效；

步骤四，根据诊断药瓶死亡率与田间防效之间的相关性，确定检测试剂盒药剂使用浓度，完成试剂盒制作。

进一步，获得诊断剂量(lc99)具体包括：

药剂室内药膜：称取原药，用丙酮配好母液。再用丙酮稀释成系列浓度梯度，分别取1.5ml注入已标记好浓度的离心管中。空白对照仅使用丙酮。将离心管上下颠倒振摇30次以上，使药剂均匀分布在管壁。倒出药液至废液桶，将离心管置于通风厨内风干过夜。挑取叶碟上饲养的个体较大均一，且活泼的3-5日龄雌成螨于处理好的离心管中，离心管收集于瓷盘中，放在恒温培养箱内24h后，取出在显微镜下观察螨，用毛笔轻触虫体，以完全不动或只有一足在动即为死亡。统计死亡数和存活数。用poloplus软件进行数据处理，求得毒力回归方程和诊断剂量lc99。

进一步，药剂frc防效测定包括：

田间施药前，手持放大镜五点法调查螨发生数，并做好标记，估算田间种群。根据检索得到的两种杀螨剂的田间推荐使用浓度(frc)，使用药剂田间常用剂型，用水稀释到相应的倍数，均匀施药，对照小区则只喷施水。喷药后1、10、15d再次调查活螨发生数。

本发明的另一目的在于提供叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的使用方法，所述叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的使用方法为：

参照室内药膜法，根据田间诊断剂量提前配置诊断试剂瓶(直径4cm，高度6cm的圆形透明玻璃瓶)，风干后拧紧盖子备用。田间测定时，把带药试剂瓶安装至手持吸螨器的收集处，对准螨的位置，30-60s即可收集30头，收集后取下试剂瓶拧紧盖子，更换新的继续收集，4h后手持放大镜观察螨的存活数。

本发明的另一目的在于提供一种由所述叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的制作方法制作的试剂盒，所述试剂盒包括：

吸螨器(副药膜瓶)，根据家用吸螨器改装：吸螨头通过胶皮管连接于吸螨器上；药膜瓶制作完成后通过螺纹连接于吸螨器下部；吸螨器主机通过螺栓固定于吸螨器内部后侧；第一铁丝网和第二铁丝网固定于吸螨器内部、吸螨器主机前部，防治叶螨进入主机。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供了一种快速、简单、便捷的包括收集、测定装置在内的叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒及使用方法，该检测试剂盒可以在4小时内快速测定和判断朱砂叶螨对常用杀螨剂的敏感性，为指导田间科学用药提供简便快捷的用具和方法。此外，本发明的收集测定装置可循环使用，极大地节约了实验成本，也符合国家倡导的环保理念。

本发明用于快速、准确、省时省力判断朱砂叶螨对丁氟螨酯、甲氰菊脂等药剂的敏感性，为合理选择防治药剂及用量提供依据；用吸虫器把10-20头健康活泼雌成螨挑入选药瓶中，盖紧盖子，丁氟螨酯4h后检查死亡率，甲氰菊脂8h后检查死亡率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的制作方法流程图。

图2是本发明实施例提供的吸螨器的结构示意图。

图中：1、吸螨器主机；2、第一铁丝网；3、第二铁丝网；4、药膜瓶；5、胶皮管；6、吸螨头。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为解决背景技术中的问题，增强田间科学用药的实用、快速、便捷。本发明提供了一套包括收集、测定在内的叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒。具体地说是有关于微小型害虫(尤其适宜于防治朱砂叶螨、二斑叶螨、苹果、柑橘全爪螨、棉叶螨等)的一种集收集、检测于一体的快速、简单、便捷的可循环田间快速检测试剂盒及使用方法。在一定程度上解决了基层技术人员及农民在使用上的技术壁垒等问题。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。

如图2所示，吸螨器(副药膜瓶)，根据家用吸螨器改装：吸螨头6通过胶皮管5连接于吸螨器上；药膜瓶4制作完成后通过螺纹连接于吸螨器下部；吸螨器主机1通过螺栓固定于吸螨器内部后侧；第一铁丝网2和第二铁丝网3固定于吸螨器内部、吸螨器主机前部，防治叶螨进入主机。

如图1所述，本发明实施例提供的叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的制作方法包括：

s101：室内药膜法生测获得朱砂叶螨敏感品系对甲氰菊酯及丁氟螨酯的4小时敏感基线(lc-p线)，计算获得诊断剂量(lc99)；并检索两种杀螨剂的田间推荐使用浓度(frc)；

s102：制作两种药剂，各三种浓度诊断药瓶(指型管)：lc99，2×lc99，frc；挑入30头左右朱砂叶螨，4小时后检测死亡率情况；

s103：室外网室饲养四种朱砂叶螨种群，使用田间推荐剂量处理各种群，药后1天，10天，15天调查田间防效；

s104：根据诊断药瓶死亡率与田间防效之间的相关性，确定检测试剂盒药剂使用浓度，完成试剂盒制作。

进一步，获得诊断剂量(lc99)具体包括：

药剂室内药膜：称取原药，用丙酮配好母液。再用丙酮稀释成系列浓度梯度，分别取1.5ml注入已标记好浓度的离心管中。空白对照仅使用丙酮。将离心管上下颠倒振摇30次以上，使药剂均匀分布在管壁。倒出药液至废液桶，将离心管置于通风厨内风干过夜。挑取叶碟上饲养的个体较大均一，且活泼的3-5日龄雌成螨于处理好的离心管中，离心管收集于瓷盘中，放在恒温培养箱内24h后，取出在显微镜下观察螨，用毛笔轻触虫体，以完全不动或只有一足在动即为死亡。统计死亡数和存活数。用poloplus软件进行数据处理，求得毒力回归方程和诊断剂量lc99。

进一步，药剂frc防效测定包括：

田间施药前，手持放大镜五点法调查螨发生数，并做好标记，估算田间种群。根据检索得到的两种杀螨剂的田间推荐使用浓度(frc)，使用药剂田间常用剂型，用水稀释到相应的倍数，均匀施药，对照小区则只喷施水。喷药后1、10、15d再次调查活螨发生数。

本发明实施例提供的叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒的使用方法为：

参照室内药膜法，根据田间诊断剂量提前配置诊断试剂瓶(直径4cm，高度6cm的圆形透明玻璃瓶)，风干后拧紧盖子备用。田间测定时，把带药试剂瓶安装至手持吸螨器的收集处，对准螨的位置，30-60s即可收集30头，收集后取下试剂瓶拧紧盖子，更换新的继续收集，4h后手持放大镜观察螨的存活数。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例：

1.供试虫源：朱砂叶螨敏感品系，室内饲养了多年所获得的品系；

朱砂叶螨云南品系，采自云南多年未施药玫瑰园；

朱砂叶螨抗性品系，室内药剂筛选多代后获得(丁氟螨酯倍数100.06倍，甲氰菊酯5.13w倍)；

均置于西南大学植物保护学院养虫室内用盆栽豇豆苗饲养，在光照培养箱内长期饲养(温度26土1℃、相对湿度60％-80％、光照l:d＝14:10h)。

2.试验药物：甲氰菊酯原药(96％)，丁氟螨酯原药(97％)

3.试验设计

室内药膜法生测获得朱砂叶螨敏感品系对甲氰菊酯及丁氟螨酯的4小时敏感基线(lc-p线)，计算获得诊断剂量(lc99)；并检索两种杀螨剂的田间推荐使用浓度(frc)。

制作两种药剂，各三种浓度诊断药瓶(指型管)：lc99，2×lc99，frc；挑入30头左右朱砂叶螨，4小时后检测死亡率情况。

室外网室饲养四种朱砂叶螨种群(敏感种群及云南品系饲养两个，其他抗性种群各一个，空白一个)，使用田间推荐剂量处理各种群，药后1天，10天，15天调查田间防效。

根据诊断药瓶死亡率与田间防效之间的相关性，确定检测试剂盒药剂使用浓度，完成试剂盒制作。

最终使用浓度基本符合以下条件：

如敏感品系：>90％，暂未产生明显抗性，抗性水平低于10倍，推荐使用；

如云南品系：60～90％，已经产生一定抗性水平，抗性水平～40倍，慎用；

如抗性品系：30～60％，已经产生高抗，抗性倍数～100倍，不推荐使用；

<30％，极高抗，抗性倍数>200倍，禁止使用。

4.试验方法

药剂室内药膜：称取原药，用丙酮配好母液。再用丙酮稀释成系列浓度梯度，分别取1.5ml注入已标记好浓度的离心管中。空白对照仅使用丙酮。将离心管上下颠倒振摇30次以上，使药剂均匀分布在管壁。倒出药液至废液桶，将离心管置于通风厨内风干过夜。挑取叶碟上饲养的个体较大均一，且活泼的3-5日龄雌成螨于处理好的离心管中，离心管收集于瓷盘中，放在恒温培养箱内24h后，取出在显微镜下观察螨，用毛笔轻触虫体，以完全不动或只有一足在动即为死亡。统计死亡数和存活数。用poloplus软件进行数据处理，求得毒力回归方程和诊断剂量lc99。

药剂frc防效测定：田间施药前，手持放大镜五点法调查螨发生数，并做好标记，估算田间种群。根据检索得到的两种杀螨剂的田间推荐使用浓度(frc)，使用药剂田间常用剂型，用水稀释到相应的倍数，均匀施药，对照小区则只喷施水。喷药后1、10、15d再次调查活螨发生数。

5.试验结果

浓度说明

根据敏感种群敏感基线，求得lc99，2×lc99，检索得到frc。

检测试剂盒浓度筛选

表1朱砂叶螨甲氰菊酯抗性检测试剂盒浓度筛选

表2朱砂叶螨丁氟螨酯抗性检测试剂盒浓度筛选

表3朱砂叶螨甲氰菊酯frc田间防效

表4朱砂叶螨丁氟螨酯frc田间防效

综合室内浓度筛选及frc田间防效测定结果，确定甲氰菊酯、丁氟螨酯的田间诊断剂量均以2×lc99为宜。

6.田间种群敏感度快速测定方法

参照室内药膜法，根据田间诊断剂量提前配置诊断试剂瓶(直径4cm，高度6cm的圆形透明玻璃瓶)，风干后拧紧盖子备用。田间测定时，把带药试剂瓶安装至手持吸螨器的收集处，对准螨的位置，30-60s即可收集30头，收集后取下试剂瓶拧紧盖子，更换新的继续收集，4h后手持放大镜观察螨的存活数。

本发明提供的叶螨类微小型害虫敏感性田间快速检测试剂盒在一定程度解决了基层技术人员及农民实际使用中经常遇到的技术、仪器及操作上的关键难题，在实际应用中具有很好的实践指导意义。手持吸螨器结合诊断试剂瓶的使用，在解决了微小型害虫的田间收集难题的同时，检测结果相对于其他方法来说更准确，4h后就能检测到实验结果，比较符合生产实际情况，能够及时为田间用药用量提供科学指导，省时省力又节约成本。带药试剂瓶使用后，可用丙酮清洗晾干后重复配药使用，不会造成田间废弃物回收、堆积的问题，也不存在田间药剂污染的隐患，积极响应了绿色环保可循环的理念。

下面结合具体实施例对本发明的应用效果作详细的描述。

实施例1

2018年6月24日，用田间快速检测试剂盒检测了重庆市璧山区试验基地豇豆上的朱砂叶螨的敏感性，将待测试虫吸入到药膜管中，4h后，对丁氟螨酯的死亡率为97.2％。检测结果表明，该地朱砂叶螨对丁氟螨酯非常敏感，可以继续使用常规剂量的丁氟螨酯防治该试验基地内的朱砂叶螨。

璧山区为大面积柑橘园，防治水平高，用药量大，但是，实施地已经有连续两年没有施用丁氟螨酯防治朱砂叶螨了，所以，该地朱砂叶螨对丁氟螨酯非常敏感，可以继续使用常规剂量的丁氟螨酯防治该试验基地内的朱砂叶螨。

实施例2

2018年7月15日，用田间快速检测试剂盒检测了重庆市石柱县蔬菜园内的朱砂叶螨的敏感性，将待测试虫接入到药膜管中，4h后，对朱砂叶螨的死亡率为92.3％，检测结果表明，该地苹果黄蚜对甲氰菊酯比较敏感，可以继续使用常规剂量的甲氰菊酯防治该试验基地内的朱砂叶螨。事实上，由于该试验基地在2018年的总体用药量很低，因而朱砂叶螨对各种农药都有较高敏感性。试验地当年施用农药现状验证了本发明诊断试剂盒的准确性和实用性。

在实施地调查发现，该实施例诊断试剂盒的检测结果与检测地的施用药剂的频率和强度相吻合，进一步验证了本发明诊断试剂盒的准确性和实用性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。