松材线虫病疫木内腐生线虫的培养基及其制备方法和应用与流程

本发明属于腐生线虫培养
技术领域：
，具体涉及松材线虫病疫木内腐生线虫的培养基及其制备方法和应用。
背景技术：
：腐生线虫是指细菌作用的糖和蛋白质分解产物为食料(刘南欣等,1982)，或者取食腐烂的有机碎片的线虫。土壤中存在着大量的腐生线虫，常常在植物根部以及植物地下部或地上部坏死和腐烂组织内外看到。松材线虫的病死木中腐生线虫也极其常见(ren-eetal,2010；李祥康等,2010；王新荣等,2008)，但人们对于松材线虫病死木内腐生线虫的形态学、生理学及生态学的研究仍然有限，其主要原因之一是腐生线虫室内培养体系不完善。无论对腐生线虫进行何种研究，其培养方法均是研究的关键。目前与松材线虫病相关的腐生线虫的培养方法报道较少，已有的对腐生线虫培养研究，被报道过的有涂有大肠杆菌op50-ngm线虫生长培养基(kanzakietal,2015)和长满灰葡萄孢(botrytiscinerea)的pda培养基(ren-e,jun,quan,xing-yao,2010)。灰葡萄孢多用于培养植物寄生线虫(季锦衣,2012；张慧波,2007)，而大肠杆菌op50主要与土壤线虫(caenorhabditiselegans)的培养相关(qiaoetal,2013；李有全等,2011)，在大鼠寄生线虫(strongyloidesratti)(dulovicetal,2016)、昆虫线虫(susoyetal,2013)等培养中也被报道过。长满灰葡萄孢的pda培养基主要用来培养植物寄生线虫，用其培养病疫木内腐生线虫需花费22-30天的时间才能获得大量的线虫，时间较长；op50-ngm培养基主要用于培养昆虫线虫，培养时间约10天，但目前暂时无人尝试利用其对松材线虫病疫木内腐生线虫进行大量培养，具体效果未可知。此外，长满灰葡萄孢的pda培养基和涂有大肠杆菌op50的线虫培养基ngm均需在接种线虫前接入共生细菌，成分复杂，且制作op50-ngm培养基的程序复杂，大肠杆菌op50为尿嘧啶缺陷型菌株，价格昂贵，菌株不易获得，且对树体内腐生线虫的培养效果、种类尚不清楚。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供松材线虫病疫木内腐生线虫的培养基，以解决现有技术中线虫培养基成分复杂，所需原材料不易获得，价格昂贵的问题；本发明所要解决的技术问题是提供松材线虫病疫木内腐生线虫的培养基的制备方法，以解决现有技术中配置程序复杂的问题；本发明所要解决的技术问题是提供上述培养基在培养松材线虫病疫木内腐生线虫中的应用，以解决现有技术中腐生线虫培养时间长的问题。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：松材线虫病疫木内腐生线虫的培养基，其配方为：松树木屑20-30g/l、葡萄糖10-20g/l、琼脂20-30g/l。进一步的，腐生线虫包括小杆目线虫、双胃目线虫、绕线虫。进一步的，松树木屑为能够分离到腐生线虫的原松属树种木质部的木屑。进一步的，松树木屑的重量为干重重量。松材线虫病疫木内腐生线虫的培养基的方法为：每升蒸馏水中加入松树木屑20-30g、葡萄糖10-20g、琼脂20-30g，高压蒸汽灭菌20min。上述培养基在培养松材线虫病疫木内腐生线虫中的应用。进一步的，培养基经高压蒸汽灭菌冷却凝固后，接种腐生线虫，培养箱中10-25℃培养10天以上，收集腐生线虫。优选，培养温度为25℃。有益效果：与现有技术相比，具有以下有益效果：1)本发明的腐生线虫培养基的组分为松树木屑、葡萄糖、琼脂，蒸馏水，组分明确，相比于长满灰葡萄孢的pda培养基或涂有大肠杆菌op50的线虫培养基ngm，所需原料易获得且价格低廉；2)本发明的腐生线虫培养基能够培养不同的腐生线虫，比如小杆目线虫、双胃目线虫，绕线虫；3)本发明的腐生线虫培养基相比于长满灰葡萄孢的pda培养基或涂有大肠杆菌op50的线虫培养基ngm，无需接入共生细菌，配置步骤简单，容易实现大规模的生产与使用；4)本发明的腐生线虫培养基在接种腐生线虫后培养10天就可以获得大量的线虫，相比于灰葡萄孢培养腐生线虫，需花费22-30天的时间才能获得大量的线虫，本发明缩短了一半以上的培养时间，加快了腐生线虫室内培养的速度，提高了培养效率。附图说明图1是葡萄糖浓度对线虫增长量的影响图；图中，柱形图中不同字母代表在0.05水平上具有显著差异；图2是木屑含量对线虫增长量的影响图；图中，柱形图中不同字母代表在0.05水平上具有显著差异；图3是琼脂含量对线虫增长量的影响图；图中，柱形图中不同字母代表在0.05水平上具有显著差异；图4是在腐生线虫培养基中培养时间对腐生线虫增长量的影响图；图中，不同字母代表在0.05水平上具有显著差异；图5是不同虫株在腐生线虫培养基中不同温度的培养结果图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。实施例1腐生线虫基础培养基筛选和主要成分的确定1)不同培养基对线虫增长量的影响将25条线虫分别接种至ngm-木屑培养基和pda-木屑培养基平板内，用封口膜封口，以不加木屑的ngm及pda作为对照，放置在25℃培养箱内培养14天后，计算每个平板内的线虫数量。ngm-木屑培养基：氯化钠3g、琼脂粉17g、胰蛋白胨2.4g、木屑20g、加水定容至1000ml，高压灭菌后，待培养液降温至60℃，在无菌条件下加入1molcacl21ml、1molmgso41ml、5mg/ml胆固醇1ml、1mol磷酸缓冲液(ph6.0)25ml，快速混匀后，制成平板，常温下保存。pda-木屑培养基：200g土豆，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸25min；纱布过滤，滤液加水补足1000ml，再加入20g木屑、20g葡萄糖及20g琼脂，高压灭菌后，快速混匀后，制成平板，常温保存。其中，木屑为能够分离到腐生线虫的原松属树种木质部的木屑且木屑的重量为干重重量。培养基制成90mm的培养基平板。不同培养基对线虫增长量的影响结果如表1所示，用ngm-木屑培养基培养的线虫数量明显低于pda-木屑培养基，方差分析结果表明，pda-木屑培养基比ngm-木屑培养基更适合线虫的生长繁殖(p＜0.05)。此外，不含木屑的两个对照中无线虫存活，由此认为木屑是腐生线虫生长繁殖的必要条件。表1不同培养基对线虫增长量的影响培养基类型线虫生长量(条)繁殖倍数ngm-木屑培养基2953.00±521.00b117.12±12.00bpda-木屑培养基9973.00±1647.00a397.20±38.60angm对照0c0cpda对照0c0c注：表中数值为平均值±标准误，不同字母代表在0.05水平上具有显著差异。2)pda培养基成分对线虫增长量的影响将25条线虫分别接种至土豆浸提液-木屑培养基、葡萄糖-木屑培养基、琼脂-木屑培养基平板内，以pda-木屑培养基作为对照，放置在25℃培养箱内培养14天后，计算每个平板内的线虫数量。土豆浸提液-木屑培养基：200g土豆，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸25min；纱布过滤，滤液加水补足1000ml，再加入20g木屑，20g琼脂。葡萄糖-木屑培养基：葡萄糖20g、木屑20g、琼脂20g，加水定容至1000ml。高压灭菌20min，待冷却至40-60℃，在超净工作台内分装至培养皿内，冷却凝固。琼脂-木屑培养基：木屑20g、琼脂20g，加水定容至1000ml。高压灭菌20min，待冷却至40-60℃，在超净工作台内分装至培养皿内，冷却凝固。其中，木屑为能够分离到腐生线虫的原松属树种木质部的木屑且木屑的重量为干重重量。培养基制成90mm的培养基平板。用pda培养基的3个成分制成木屑培养基培养的线虫增长量如表2所示。从用4种培养基的培养效果来看，葡萄糖-木屑培养基内线虫的增长量最多，与其他处理均存在显著性差异(p＜0.05)；其次为琼脂-木屑培养基和pda-木屑培养基，两者间无显著性差异(p>0.05)。但在实际操作过程中发现，pda-木屑培养基和土豆浸提液-木屑培养基内有大量细菌繁殖，由表2可知，土豆浸提液-木屑培养基内无线虫生长，由此认为这可能与土豆浸提液有关。表2不同的培养基成分对线虫增长量的影响培养基类型线虫生长量(条)繁殖倍数土豆浸提液-木屑培养基0c0c葡萄糖-木屑培养基23880.00±1300.00a954.20±30.03a琼脂-木屑培养基11520.00±3070.00b459.80±122.79bpda-木屑培养基10686.00±1135.00b426.47±45.41b注：表中数值为平均值±标准误，不同字母代表在0.05水平上具有显著差异。实施例2培养基主效应因子的筛选1)葡萄糖浓度对线虫增长量的影响通过单因素试验，考察葡萄糖浓度对线虫增长量的影响。在基础培养基的基础上，改变葡萄糖的浓度，即葡萄糖浓度为10、15、20、25、30g/l时，接种25条腐生线虫，25℃下培养14天后计算每个平板内的线虫数量。由图1可知，随着葡萄糖浓度的改变，线虫的增长量也随之改变。当葡萄糖浓度在20g/l和25g/l，线虫的数量与其他处理存在显著性差异(p＜0.05)，分别为16640.00条和16613.33条，但两处理间无显著性差异(p＞0.05)。2)木屑含量对线虫增长量的影响在基础培养基的基础上，考察木屑含量在10、20、30g/l时，对线虫增长量的影响。接种25条腐生线虫，25℃下培养14天后计算每个平板内的线虫数量。由图2可知，木屑含量的改变对线虫增长量存在明显的影响。当木屑含量在20g/l时，线虫数量最多，达9615条，与其他两个处理均呈显著性差异(p＜0.05)。3)琼脂含量对线虫增长量的影响在基础培养基的基础上，保持其他的条件不变，只改变琼脂的含量。分析琼脂含量在10、20、30g/l时对线虫生长繁殖数量的影响。接种25条腐生线虫，25℃下培养14天后计算每个平板内的线虫数量。由图3可知，线虫的增长量随着琼脂含量的变化而变化，当琼脂含量为20g/l时，线虫的增长量最多，与其他两个处理存在显著性差异(p＜0.05)。实施例3优化培养基配比选用葡萄糖、木屑、琼脂3个培养基成分，设计3因素3水平的正交试验，优化培养基配比。通过正交试验表3可看出，第8组试验结果最佳，所以木屑30g/l、葡萄糖20g/l、琼脂30g/l，为试验最优水平组合。计算每个水平上的重复指标和，用k1、k2、k3表示，然后通过比较k1、k2、k3对应各列因子的水平效应估计值，，可以得出腐生线虫培养基的理论最优组合配比为：木屑30g/l、葡萄糖10g/l、琼脂30g/l。表3正交试验表分别以试验最优组合和理论最优组合的培养基配比培养25条腐生线虫，14天后，结果如表4所示。从试验最优组合培养基中分离到16443.33条线虫，从理论最优组合培养基中分离到10316.67条线虫。利用t检验计算方差齐性得出p＝0.21，两个处理间的差异不显著(p＞0.05)。由此认为腐生线虫培养基的最优配比为：木屑30g/l、葡萄糖10-20g/l、琼脂30g/l。表4不同的培养基的配比方案对线虫增长量的影响方案线虫增长量试验最优组合16443.33±3019.21a理论最优组合10316.67±2830.24a注：表中数值为平均值±标准误，字母代表在0.05水平上具有显著差异实施例4优化的腐生线虫培养基验证1)培养时间对线虫生长数量的影响接种25条腐生线虫(每6条腐生线虫中，保证1条以上雄成虫；若存在雌成虫，可接种5条雌成虫，若无，保证有雌成虫的情况下，其余可为幼虫。)在优化后的腐生线虫培养基(蒸馏水1l、木屑30g/l、葡萄糖20g/l、琼脂30g/l)内，放入25℃培养箱，在第6、8、10、12、14、16天分离腐生线虫，观察在腐生线虫培养基内，时间对线虫增长量的影响。第6、8、10、12、14、16天线虫的数量分别为2860条、5284条、10488条、9992条、16440条、20433条，繁殖倍数分别为113.70倍、210.37倍、418.85倍、398.70倍、656.60倍、816.33倍。自第6天起到第16天，腐生线虫数量始终处于增加的状态，第12天线虫数量虽低于第10天，但两者间的差异不显著(p>0.05)。2)不同温度下，不同线虫在腐生线虫培养基上的生长情况将200条小杆目线虫(oscheiussp.)、双胃目线虫(diplogastrellussp.)、绕线虫(plectussp)(oscheiussp.、diplogastrellussp.、plectussp.虫株均从松材线虫病疫木内分离获得)接种至优化后的腐生线虫培养基中，放置在10、15、20、25℃的梯度培养箱中培养24天，观察不同腐生线虫、不同温度在腐生线虫培养基内的生长状况。结果如图4所示，3种线虫在腐生线虫培养基上均能繁殖生长，且在25℃时3种线虫的生长量均达最高。15℃和20℃时，3种线虫均能生长，但线虫的生长数量均低于25℃；在10℃时，3种线虫生长均受到了抑制。需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12