徐长卿中C21甾体类化合物1-8在制备抗TSWV活性产品中的应用的制作方法

本发明属于生物农药领域，具体涉及徐长卿中分离得到的c21甾体类化合物1-8作为防控tswv的制剂，在制备抗tswv活性产品中的应用。

背景技术：

番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus,tswv)是布尼亚病毒科(bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(tospovirus)的代表种，它的寄主范围非常广泛，许多重要经济作物(如烟草、辣椒、番茄)都易被感染，进而造成严重的经济损失，因此被列为世界十大植物病毒之一。目前生产上防治病毒病害主要通过防虫防病，但其传播介体易产生抗药性，农作物易产生农药残留超标等问题，加之抗病品种缺乏，生产上尚缺乏有效的防控措施。此外，相较于传统的化学防治，植物源抗病毒剂具有安全环保、低毒或无毒、易降解、不易产生抗性等优点。因而寻找具有抗tswv活性的植物源抗病毒先导化合物，研发抗病毒新型生物源农药将是防治病毒病的重要途径之一。目前市售的从南板蓝根中提取的安托芬以及从植物中提取的毒氟磷均是能有效抑制tmv活性的生物源农药。有关tswv生物活性药剂筛选方面，赵永发等进行了菠菜等作物粗提物抗tswv的活性试验，其中商陆和菠菜的粗提物对tswv的抑制效果分别达到94.81％和92.63％；陈永对等也通过田间施用aho(3-acetony13-hydroxyoxindole)发现对tswv有一定的防控效果。目前研究发现从徐长卿(cynanchumpaniculatum(bunge)ktag)中获得的c21甾体类化合物具有抗病毒、防虫、杀菌等活性，但是目前未有徐长卿中分离得到的c21甾体类化合物作为防控tswv的制剂，在制备抗tswv药物中的应用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供徐长卿中c21甾体类化合物1-8在制备抗tswv活性产品中的应用，在制备tswv抑制剂中的应用，在制备tswv防控剂中的应用，在制备tswv预防剂中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

如下结构式所示的徐长卿中c21甾体类化合物1-8在制备抗tswv活性产品中的应用，

徐长卿中c21甾体类化合物1-8在制备tswv防控剂中的应用。

徐长卿中c21甾体类化合物1-8在制备tswv抑制剂中的应用。

徐长卿中c21甾体类化合物1-8在制备tswv预防剂中的应用。

如所述的应用，其中所述的化合物浓度为100μg/ml。

所述的应用，其中c21甾体类化合物为从徐长卿中提取得到的c21甾体类化合物。

所述的应用，其特征在于所述的c21甾体类化合物由下述方法获得：徐长卿干燥根茎粉碎后经95％甲醇回流提取3次，每次两小时，浓缩得到总浸膏用水溶解后用二氯甲烷萃取3次。将二氯甲烷层用60-80目硅胶拌样，用硅胶(200-300目装柱进行梯度洗脱,洗脱液为石油醚-丙酮(1:0到1:2)到二氯甲烷-甲醇(10:1到0:1)。相同组分合并后得到8个组分(a-h)。其中石油醚/丙酮2:1部分硅胶柱层析、反向rp-18柱、sephadexlh-20凝胶柱,再经半制备、制备柱hplc等更细致地分离，得到化合物1-8。

与现有技术相比，本发明化合物对tswv表现出不同程度的预防效果，其中化合物4、化合物5的抑制率超过对照药剂宁南霉素(抑制率为61.2％)，且病毒含量也少于宁南霉素。其余6个化合物对tswv表现出不同程度的预防效果。

附图说明

图1为接种3天后化合物的预防效果图(化合物浓度为100g/ml；所有结果均以均数±标准差表示；所有组n＝6)；

图2为接种3天后化合物防控试验中病毒相对含量(od值大于1.5倍空白对照说明含有病毒；阳性对照：tswv；阴性对照：健康植株；空白对照：pbs)。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1

化合物提取和分离：

徐长卿干燥根茎粉碎后经95％甲醇回流提取3次，每次两小时，浓缩得到总浸膏用水溶解后用二氯甲烷萃取3次。将二氯甲烷层用60-80目硅胶拌样，用硅胶(200-300目装柱进行梯度洗脱,洗脱液为石油醚-丙酮(1:0到1:2)到二氯甲烷-甲醇(10:1到0:1)。相同组分合并后得到8个组分(1-8)。其中石油醚/丙酮2:1部分硅胶柱层析、反向rp-18柱、sephadexlh-20凝胶柱,再经半制备、制备柱hplc等更细致地分离，得到化合物1-8。

用上述方法得到的化合物1-8结构式如下：

方法

1毒源的制备

番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus,tswv)由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，寄生于活体植株本氏烟上，之后纯化保存于-80℃冰箱，接种于5-6真叶期烟叶上，5～7d后采集接种叶的上位叶(系统叶)样品，加入接种缓冲液进行研磨，研磨成汁液后待用。用感病植物汁液接种，接种浓度为100mg/ml。

2化合物制剂的制备

化合物用二甲基亚砜(dmso)溶解，浓度为10mg/ml，再用无菌水稀释成100μg/ml进行活性筛选，每种化合物制剂作为一种处理，宁南霉素按照说明书用无菌水稀释成浓度80μg/ml。

3预防试验

挑选健康合适的普通烟，暗室放置一夜。选择生长一致的5-6片真叶期的烟苗，于第4片和第5片真叶上均匀涂抹化合物制剂，直至化合物制剂用完(1ml)，10min后用清水冲洗，6h后摩擦接种tswv，10min后用清水冲洗。同时设3个对照，阴性对照：先涂抹dmso(100μg/ml)，6h后接种tswv，用于计算抑制率；阳性对照：先施宁南霉素，6h后接种tswv；空白对照：只涂抹dmso。接种后将烟苗放置于无虫温室中，每个处理重复3次实验，接种病毒3-4d后统计枯斑数，并计算抑制率，同时采集样品进行elisa检测病毒相对含量。

抑制率(％)＝(1-(处理的平均枯斑数/阴性对照的平均枯斑数))/100

4实验结果由于普通烟属于tswv的枯斑寄主，可以通过比较只接种病毒的叶片和经化合物处理叶片的枯斑数量及枯斑大小来判断化合物是否抑制了病毒的侵染。表1为化合物1-8在不同浓度下与对照药物“宁南霉素”在普通烟上对tswv侵染抑制率的比较，有结果可知，涂化合物3d后调查结果发现，8个化合物对tswv表现出不同程度的预防效果，其中化合物4、化合物5的抑制率超过对照药剂宁南霉素(抑制率为61.2％)(见图1和图2)。