专利名称:扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种扩繁植物雄性不育系的新方法，该方法利用细胞核雄性不育基因、控制籽粒特殊形状(如大小、长短、宽窄、薄厚等)基因及转基因技术扩繁植物雄性不育系，属于植物遗传育种及种子生产领域。
背景技术：
由于杂种优势的存在，使得杂交种的生物量、抗病虫能力、耐胁迫(干旱、高温、低温、盐碱等)能力较其双亲有相当的提升，如杂交玉米、杂交水稻的产量远远高于纯合的双 亲。生产杂交种通常采用的方法为将雌性亲本和雄性亲本种在一起，将雌性亲本的雄穗去除，而保留雄性亲本的雄穗，雌性亲本收获的种子即为杂交种。
自然界中的植物存在自花授粉、异花授粉及常异花授粉三种类型，自花授粉指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。在两性花的植物中，又可分为同一花的雄蕊与雌蕊间进行授粉的同花授粉(菜豆属)和在一个花序(个体)中不同花间进行授粉的邻花授粉，以及同株不同花间进行授粉的同株异花授粉。有的植物雄蕊和雌蕊不长在同一朵花里，甚至不长在同一棵植株上，无法自花授粉，它们的雌蕊只能得到其他花的花粉，这叫做异花授粉。将天然杂交率高于50%且自交衰退的一类作物归为常异花授粉作物，如玉米。
玉米为雌雄同株，并且雌雄花位于植株的不同部位，玉米既可通过自花授粉也可通过异花授粉繁衍后代，自然条件下，当风将花粉从雄穗吹到雌穗的花丝上时即完成了天然授粉。
在玉米育种中首先应开发出纯合的玉米自交系，然后将两个自交系进行杂交，对杂交的后代进行产量、抗逆性等进行评估，以确定其是否具有商业化潜力。其中每个自交系都可能具有另一个自交系所缺乏的一种或多种优良性状，或补充另一个自交系的一种或多种不良性状。两个自交系杂交的第一代种子为Fl代种子，Fl代的种子发芽后获得Fl代植株，Fl代植株较两个自交系亲本(父母本)更健壮，同时拥有更多的生物量。
可以通过对母本人工去雄来生产杂交种，即将未散粉的母本(其可与父本在田间间隔播种，如播种5行母本，一行父本)雄穗去除，保留父本雄穗。随后，只要对外来玉米花粉进行隔离，母本雌穗只能接受父本的花粉，得到的种子即为杂交种(Fl)，该杂交种即可用于农业生产。
在生产杂交种的过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，以上两种情况均能导致母本自交授粉，致使生产的杂交种中混杂了母本自交系的种子，母本自交系的产量远低于杂交种的产量，这样的种子为不合格产品，即会影响农民收入又会影响制种公司信誉，严重的将导致制种公司承担相应的赔偿责任。
也可采用机器对母本进行去雄，机器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快并且成本更低。然而，较之手工去雄，大多数去雄机器会对植株造成更大的破坏，因此，目前没有令人完全满意的去雄手段，人们仍在寻找成本更低，去雄更彻底的替换方法。[0009]稳定的雄性不育系统提供了简单高效的手段，通过使用核-质互作雄性不育(CMS)自交系，可以在一些基因型中得以避免繁重的去雄工作。该手段包括三个主要材料，即不育系雄性不育材料，保持系可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系，恢复系可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生F1，即用于农业生产的杂交种。更具体的说，核-质互作不育型，表现为核-质互作遗传。不但需要细胞质有不育基因S，而且需要细胞核里有纯合的不育基因(rfrf)，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。如胞质基因为可育N，则不论核基因是可育(RfRf)还是不育(rfrf)，都表现为雄性可育。同样，如核里具有可育基因(RfRf)或(Rfrf)，则不论胞质基因是可育N还是不育S，也都表现为雄性可育。这种由核-质互作形成的雄性不育系，其遗传组成为S(rfrf)，不能产生正常的花粉，但可作为杂交母本。由于能找到保持系N(rfrf)[用它与不育系杂交，所产生的Fl仍能保持雄性不育，即S(rfrf)(早)XN(rfrf) — S (rfrf)(不育)]并能接受恢复系S(RfRf)或N(RfRf)[用它们与不育系杂交，所产生的Fl都是可育的，S卩S(rfrf)(早)X S (RfRf) — S (Rfrf) (Fl)(可育)，或 S (rfrf)(早)XN(RfRf) — S (Rfrf) (Fl)(可 育)]的花粉，使Fl恢复为雄性可育，Fl植株自交产生F2，所以在农业生产上可以广泛应用。雄性不育系可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、蓖麻、甜菜和油菜等作物已经利用核质互作雄性不育进行杂交种子的生产；对其他作物的核_质互作雄性不育系，也正在进行广泛的研究。
CMS也有它的缺陷，一是观察到个别CMS材料容易感病，二是恢复系比较难寻找，这些问题阻碍了 CMS系统在制种中的广泛应用。
Brar et al的美国专利4654465和4727219中公开了一种类型的遗传不育性。但是，这种类型的遗传不育需要在基因组内的多个不同位点保持相应的基因型，需要每代对这些位点进行分子标记跟踪检测。Patterson还描述了一种可能有用的染色体易位基因系统，但该系统更为复杂(见美国专利No. 3861709和3710511)。
人们一直在尝试对雄性不育系统进行优化,例如,Fabijanski,et al.开发了使植物雄性不育的方法(EP0 89/3010153. 8公开号329308和作为WO 90/08828公开的PCT申请PCT/CA90/00037)。主要是通过以下两种途径抑制植株的雄花育性，一种方法是将雄性组织特意表达的启动子与细胞毒素基因相连转入植株中，使雄花不能正常散粉同时不影响其他性状；另一种是通过基因干扰手段，将已经克隆的控制植株雄花育性的基因通过转基因的手段将其干扰，从而使其不能正常行使功能。还有通过一些基因调控元件来抑制基因表达，从而影响植株育性的手段(W090/08829)。
在多数情况下，只有控制雄性不育的核基因隐性纯合(msms)植株才会表现为雄性不育，由于雄性不育植株无法自交，因此只能通过杂合植株(Msms)与其杂交，才会得到雄性不育植株(msms)。并且在同一果穗上雄性不育籽粒(msms)与可育的杂合籽粒(Msms)同时存在，通过籽粒无法分辨哪些是不育籽粒，哪些是可育籽粒，只能通过播种后，植株散粉时才可分辨。
近年来，也有利用转基因的手段来保持雄性不育植株的不育性(US6743968)。该方法将花粉致死基因与雄性生育能力恢复基因构建在一个载体中，导入雄性不育植株中，转基因后代表现为可育，但只能产生不含恢复基因的花粉。当这样的植株与雄性不育植株杂交，便保持了隐性不育植株的纯合隐性状态。其首先构建一个转基因载体，该载体含有一个花粉细胞致死基因，同时该载体还含有一个恢复植株育性的显性基因。将该载体转入雄性不育植株，并且该载体在转基因植株中以杂合状态存在，由于恢复育性基因的存在使得植株可育，当其与雄性不育植株杂交，由于含有恢复基因的花粉(Msms)同时含有致死基因，使得花粉败育，因此只有不含恢复基因的花粉(ms)才能与雄性不育植株雌配子(ms)进行杂交，后代均为隐性纯合个体(msms)。
如前文所述，采用雄性不育系统制种的很多工作的一个重要问题在于如何利用雄性不育基因及如何分辨雄性不育种子及可育种子，同时还需要考虑如何将不育个体的不育性保持下来。
在玉米中已经鉴定了多种雄性不育突变体(Skibbe et al. 2005)，具体见下表
表一由核基因引起的雄性不育突变体
权利要求
1. 一种方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括 (a)提供第一植株，其包含使植物雄性不育的纯合隐性等位基因； (b)提供第二植株，该植株包含同第一植株相同使植物雄性不育的纯合隐性等位基因，并且含有下述构建体，所述构建体在植株中以杂合状态存在，所述构建体包含 ·1.第一核苷酸序列，当在第一植株中表达时将恢复其雄性生育力； ii.第二核苷酸序列，当其以杂合状态存在时即可影响籽粒特殊形状(如大小、长短、宽窄、薄厚等)，通过肉眼或仪器可以分辨含有该构建体的籽粒和不含有该构建体的籽粒； iii.第一核苷酸序列与第二核苷酸序列紧密相连，这两个核苷酸序列在植株中同时存在。
(c)用所述第二植株的雄性配子与第一植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。
2.—种DNA构建物，该构建物如权利要求
I所述的构建物。
3.—种植物,该植物如权利要求
I所述的第二植株。
4.一种植物，利用权利要求
I所述方法产生的纯合隐性的雄性不育植株。
5.利用权利要求
I所述方法产生的纯合隐性雄性不育植株在生产杂交种中的用途。
专利摘要
本发明公开了一种高效的种子标记方法，利用该方法可以扩繁植物雄性不育种子，为杂交制种带来便利。进一步，本发明利用控制植物雄性生育能力、籽粒特殊形状(如大小、长短、宽窄、薄厚等)的核苷酸序列及转基因技术，发明了一种高效扩繁植物雄性不育系的新方法。本发明将控制雄性生育能力的野生型核苷酸序列和籽粒形状的核苷酸序列连在一起转入常规玉米，然后回交到纯合隐性雄性不育系植株，利用获得的转基因植株与纯合隐性不育系杂交后，可以同时得到大量的不育系和保持系种子。由于控制籽粒形状核苷酸序列的作用，可以通过籽粒形状区分不育系和保持系。其中形状正常的种子为不育系(不含转基因序列)，形状异常(如籽粒变小)的种子为保持系。
文档编号C12N15/63GKCN102960234SQ201210406155
公开日2013年3月13日 申请日期2012年10月23日
发明者赖锦盛, 赵海铭, 宋伟彬, 崔阳 申请人:中国农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan