一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及薄壳山核桃的组织培养方法，具体的说是薄壳山核桃的体细胞胚胎组 织培养方法。
【背景技术】
[0002] 薄壳山核桃，又名美国山核桃，系胡桃科、山核桃属中的一个种。原产美国和墨西 哥，是世界上重要的油料干果树种之一，其壳薄易剥、仁肉肥厚、味香可口，具有较高的营养 价值。树干通直、树形优美、根深叶茂，是四旁绿化及园林观赏的优良树种。同时木材坚韧 致密、心材暗红、边材黄白、富弹性、不易变形和开裂，是建筑、高级家具等优良用材树种。因 此，薄壳山核桃是一个用途广、受益期长、经济效益高、社会效益和生态效益明显的优良经 济树种。
[0003] 我国自20世纪初即开始进行薄壳山核桃的引种栽培，但是由于其结果迟、适合各 地的优良品种缺乏等因素，目前薄壳山核桃在我国尚呈零星分布，真正形成产量的、稳产高 产的果用园尚不多见。且虽然薄壳山核桃种子春、秋均可播种。无论是春播还是秋播，种子 易被鼠、鸟啃食。有时天气干旱，种子失水，出苗率低。春播一般在3月下旬或四月上旬进 行。但是不管是春播或者是秋播，一年生的实生苗很难可以达到可嫁接的程度，生长缓慢。 为了使得薄壳山核桃尽快踏上良种化、基地化建设的进程，在良种催芽培养的同时，着手进 行砧木嫁接技术攻关，但是由于嫁接成活率不高，导致嫁接苗供不应求，因此，只好栽培实 生苗，然而实生苗存在投产迟、坚果小，适应性差等缺陷，市场上不受欢迎，因此，制约生产 发展的关键因素有两个，一个是缺乏充足的优良品种苗木，另一个是缺乏科学系统的栽培 技术。
[0004] 本领域技术人员也从事种植大量薄壳山核桃育苗工作，重点进行了薄壳山核桃扦 插和嫁接等无性繁殖实验，但繁殖系数较低，苗木质量参差不齐，现有技术中薄壳山核桃的 无性繁殖技术仍停留在尝试性试验阶段，还没有形成一种可以大量推广和重复验证的成熟 方法。因此，提供一个系统的薄壳山核桃育苗方法是本领域急待解决的技术问题。为满足 生产方面的需求，我们对常规播种的方法进行了改良，并对嫁接方法进行创新，以达到缩短 育苗周期、增加育苗数量的目的。
【发明内容】
[0005] 发明目的：建立薄壳山核桃胚发生技术体系，实现薄壳山核桃优选单株规模化高 效生产。
[0006] 技术方案：本发明提供了一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，其特征在于：包 括以下步骤：
[0007] (1)选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5~6cm的带 芽小段；
[0008] (2)对带芽小段外植体进行消毒处理；
[0009] (3)芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤（2)中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化 变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11~20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基 的配方为：WPM基本培养基，附加 0? 05 ~0? 08mg.Ll-BA、。. 05 ~0? 06mg.I^NAAdS~40g. L1鹿糖、18~21g.厂1蜂胶乳油、11~13g.厂1朽1檬酸、6. 5~7. 0g.厂1卡拉胶，调pH值为 5. 2 ~5. 4 ;
[0010] ⑷体胚诱导：将步骤⑶中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培 养 15 ~30d;MS基本培养基，附加 0? 16 ~0? 20mg.Ll-BA、。. 2 ~0? 3mg.I^NAA、。. 08 ~ 0? 12mg.L4_D、0. 05 ~0? 06mg.L1 玉米素，25 ~40g.L1 鹿糖、9. 5 ~11. 0g.L-1 酵母霄、 6. 5~7. 0g.L-l卡拉胶，调pH值为5. 7~5. 8 ;
[0011] (5)体胚增殖培养：将步骤（4)中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20~25d后， 体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1. 8~ 2.Omg.Lh-BA、。. 01 ~0? 03mg.LiNAA、25 ~40g.L1 鹿糖、6. 5 ~7. 0g.L1 卡拉胶、0? 05 ~ 0? 08mg.L芸苔素内酯、0? 03~0? 06mg.L长春碱，调pH值为5. 7~5. 8 ;
[0012] (6)成熟培养：将步骤（5)中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶 中培养32~51d;体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40~60g.I71蔗糖、6. 5~ 7. 0g.I71卡拉胶，调pH值为5. 7~5. 8 ;
[0013] (7)体胚的萌发：将步骤（6)中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42~ 58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8~12g.I71山梨醇、 20~30g.I71鹿糖、6. 5~7. 0g.L-1卡拉胶，调pH值为5. 7~5. 8。
[0014] 进一步地，所述步骤（2)中的消毒处理过程包括：将采集的枝条去除2/3叶片后修 剪成约4~6cm长的带腋芽茎段，洗涤剂浸泡20min，流水冲洗30次，蒸馏水清洗外植体后， 用无菌水冲洗3~4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用70%的酒精浸泡20s，无菌水 冲洗2~3次，再用0. 1 %升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗6次；
[0015]进一步地，所述步骤（3)、步骤（4)、步骤（5)、步骤（6)和步骤（7)中的培养条件 为：光照强度为1800~25001x，每日光照时间为16h，温度为（25±3)°C。进一步地，所述 的WPM基本培养基即木本植物培养基的具体配方如下：
[0016]
[0017] 进一步地，所述的MS基本培养基的具体配方如下：
[0018]
[0019]
[0020] 有益效果：本发明的相对于现有技术而言具有以下优点：以无菌瓶苗叶片作为外 植体进行体胚诱导，克服了离体培养外植体取材受季节限制的缺点，另外通过建立本再生 体系，大大提高了薄壳山核桃的再生效率和繁殖系数，并且其成苗率和后期抗病能力都得 到了较大提升，克服了无性繁殖实验的繁殖系数较低，质量参差不齐的缺点。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
[0022] 以下实例例所用的基本培养基的配方如下：
[0023] 所述的WPM基本培养基即木本植物培养基的具体配方如下：
[0024]
[0025]
[0026] 所述的MS基本培养基的具体配方如下：
[0027]
[0028]
[0029] 实施例1:
[0030] 一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，包括以下步骤：
[0031] (1)选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5~6cm的带 芽小段；
[0032] (2)对带芽小段外植体进行消毒处理；消毒处理过程包括：将采集的枝条去除2/3 叶片后修剪成约4~6cm长的带腋芽茎段，洗涤剂浸泡20min，流水冲洗30次，蒸馏水清洗 外植体后，用无菌水冲洗3~4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用70 %的酒精浸泡 20s，无菌水冲洗2~3次，再用0. 1 %升采溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗6次；
[0033] (3)芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤（2)中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化 变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11~20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基 的配方为：WPM基本培养基，附加0? 08mg.L-h-BA』. 05mg.I^NAAdSg.L-1鹿糖、18g.L-1蜂胶 乳油、llg.L4梓檬酸、6. 5g.厂1卡拉胶，调pH值为5. 2 ;
[0034] (4)体胚诱导：将步骤（3)中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养 15~30d;体胚诱导培养基配方为，MS基本培养基，附加0.20mg. 2mg. PNAA、 0? 08mg. d,4_D、0. 05mg. I71 玉米素，25g. L-1 鹿糖、9. 5g. L-l酵母膏、7. 0g. L-l卡拉胶，调pH值为5. 7;
[0035] (5)体胚增殖培养：将步骤（4)中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20~25d后， 体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加2. Omg. L^-BAaO. Olmg. I^NAAdOg.I71 鹿糖、6. 5g. Lh卡拉胶、0? 08mg. L芸苔素内醋、0? 03mg. L长 春碱，调pH值为5. 7;
[0036] (6)成熟培养：将步骤（5)中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中 培养32~51d;体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加60g.I71蔗糖、6. 5g. 卡拉 胶，调pH值为5. 7 ;
[0037] (7)体胚的萌发：将步骤（6)中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42~ 58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8g.I71山梨醇、20g. L4蔗糖、6. 5g.厂1卡拉胶，调pH值为5. 7。
[0038] 实施例2 :
[0039] 本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：
[0040] (1)芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加O.Oemg.I^e-BA^Oemg-L-iNAAdOg.L-1 蔗糖、 21g.L―1 蜂胶乳油、 13g.L―1 柠檬酸、 7.Og.L―1 卡拉胶，调pH值为 5. 3。
[0041] (2)体胚诱导培养基配方为，MS基本培养基，附加0? 16mg. [VBA』. 3mg.PNAA、 0? 08mg.d, 4_D、0. 06mg.I71 玉米素，25g.L-1 鹿糖、11.Og.L-l酵母膏、6. 5g.L-l卡拉胶，调 pH值为5.8。
[0042] (3)体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加2.Omg.L-VBA』.Olmg.PNAA、 25g.I71鹿糖、6. 5g.