一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产动物繁殖生物学技术领域，具体涉及一种可持续性观察大刺鳅胚 胎发育的方法。
【背景技术】
[0002] 大刺鳅（Mastacembelusarmatus)在分类上隶属于自卢形目，刺鳅亚目，刺鳅科，刺鳅 属。俗称纳锥，石锥，粗麻割，辣椒鱼，刀枪鱼。成年鱼体长30~50厘米，体重200~500克，最 大个体可达2. 5kg，肉细坚实，香甜可口，营养丰富。主要分布于长江以南的各水系，以广东、 广西、福建等地江河中的野生资源尤为丰富。20世纪80年代以后，由于酷渔滥捕和江河环 境污染，大刺鳅的江河野生资源遭到严重破坏，资源枯竭，广东、福建、贵州等省份已将其列 入重点保护的野生水生动物之一。目前，尽管已有大刺鳅胚胎发育观察方面的研究，但由于 受精卵卵壳厚，一般只能局限于定期显微拍摄再用Photoshop软件处理，未能实现持续性 显微观察，难于得到清晰的胚胎发育图像以保证正确的观察结果，从而极大影响大刺鳅繁 殖生物学方面研究进展，不利于大刺鳅规模化人工繁殖技术研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法。
[0004] 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，是用胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理后 进行持续性显微观察。
[0005] 进一步地，所述胰蛋白酶溶液的浓度是l~3g/L。
[0006] 进一步地，所述胰蛋白酶的比活为200~300U/mg。
[0007] 进一步地，所述胰蛋白酶溶液的用量为用量为每个培养皿加3~5mL。
[0008] 进一步地，所述用胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理具体为：往装有大刺鳅受精 卵的培养皿加入胰蛋白酶溶液，每隔Imin震荡培养皿5~10s，当培养皿中1/3~1/2的受精 卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以终止胰蛋白酶的作用。
[0009] 进一步地，所述持续性显微观察具体为：将受精卵放在体视显微镜进行连续观察， 在每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄。
[0010] 进一步地，该方法包括以下步骤： (1) 胰蛋白酶溶液的配制：称量〇.2g胰蛋白酶于容器瓶中，加入IOOmL蒸馏水，加盖后 不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成2g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用； (2) 大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地 分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在25~35粒，从获得受精卵到开始加入胰蛋白 酶溶液在3min内完成，然后往培养皿加入胰蛋白酶溶液，每隔Imin震荡培养皿5~10s，当 培养皿中1/3~1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以 终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成； (3)受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微 镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄， 并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。
[0011] 本发明具有以下有益效果： 采用本发明的方法观察大刺鳅胚胎发育，利用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵进行处理后， 使受精卵外膜变薄，透明，可进行持续性显微观察，观察过程视野清晰，结果可靠。与前人研 究相比，其发育时间、持续时间及发育特征出现较大差别；与未经胰蛋白酶处理的同批次受 精卵相比，胚胎发育过程中，各发育阶段特征更清晰，尤其是放射状受精孔出现，红色动、静 脉血循环系统的形成等特征，将鱼类胚胎发育研究水平提高到新的阶段，具有巨大的研究 及参考价值。本发明为大刺鳅胚胎发育持续性观察提供了有效的途径和方法，保证了观察 结果的正确性，能极大推动大刺鳅繁殖生物学方面研究。
【附图说明】 图1为实验组的受精卵， 图2为实验组的肌肉效应期， 图3和图4分别是未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵(对照组)的受精卵时期和肌肉效 应期。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明： 实施例1 按照以下步骤观察大刺鳅胚胎发育的过程： 1实验条件的准备 实验材料包括经人工催产大刺鳅亲本获得的受精卵、胰蛋白酶、蒸馏水、培养皿等，以 及可进行显微摄影的双目体视显微镜、电脑、摄像装置等一套；实验操作及观察过程均在恒 温实验室中进行，室内气温控制在26±0. 5°C ; 2胰蛋白酶溶液的配制 称量0. 2g胰蛋白酶（比活为250U/mg)于容器瓶中，加入IOOmL蒸馏水，加盖后不停摇 晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成2g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用； 3大刺鳅受精卵的获得及处理 经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地分布在12个培养皿中，其中实验 组8个，对照组4个，每个培养皿的受精卵数量控制在30粒左右，从获得受精卵到开始加入 胰蛋白酶溶液在3min内完成，然后往实验组每个培养皿加入4mL胰蛋白酶溶液，每隔Imin 轻轻震荡培养皿5~10s，使受精卵与胰蛋白酶溶液充分混和，当培养皿中1/3左右的受精卵 开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以终止胰蛋白酶的作用，从受 精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成； 4受精卵的持续显微观察及日常管理 将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶 段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄，与此同时观察并拍摄对照组的受精卵，并 记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3 ; 5观察结果 在26±0. 5°C条件下，大刺鳅受精卵从人工授精到鱼苗孵出整个过程历时72. 5h，分 别经过受精卵、胚盘隆起、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生和出膜等8个连续发育阶 段，根据大刺鳅胚胎发育顺序及形态变化情况，将整个发育过程分为23个时期，如表1所 示，根据胚胎发育各阶段持续时间长短及水温，推算出整个胚胎发育过程需要的总积温为 1885±36. 25°C · h。
[0013] 表1大刺鳅的胚胎发育过程
图1为实验组的受精卵，图2为实验组的肌肉效应期，图3和图4分别是未经胰蛋白酶 处理的同批次受精卵(对照组）的受精卵时期和肌肉效应期。