[0014] 由表1和图1~4可知，利用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵处理后，使受精卵外膜变薄， 透明，可进行持续性显微观察，视野清晰，结果可靠，与未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵 相比，胚胎发育过程中，各发育阶段特征更清晰，尤其是放射状受精孔出现，红色动、静脉血 循环系统的形成等特征。
[0015] 在现有技术(参见大刺鳅胚胎发育观察，淡水渔业，2014 (3):101~104)中，没有用 胰蛋白酶对大刺鳅受精卵处理，图片要用Photoshop处理，观察到的胚胎发育过程没有本 实施例清晰可靠。
[0016] 实施例2 按照以下步骤观察大刺鳅胚胎发育的过程： (1) 胰蛋白酶溶液的配制：称量0.1 g胰蛋白酶（比活为200U/mg)于容器瓶中，加入 IOOmL蒸馏水，加盖后不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成lg/L的胰蛋白酶溶液，放置在 恒温实验室待用； (2) 大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地 分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在30粒左右，从获得受精卵到开始加入胰蛋白 酶溶液在3min内完成，然后往每个培养皿加入3mL胰蛋白酶溶液，每隔Imin轻轻震荡培养 皿5~10s，当培养皿中1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗5 次以终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成； (3)受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微 镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄， 并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。
[0017] 实施例3 按照以下步骤观察大刺鳅胚胎发育的过程： (1) 胰蛋白酶溶液的配制：称量〇.3g胰蛋白酶（比活为300U/mg)于容器瓶中，加入 IOOmL蒸馏水，加盖后不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成3g/L的胰蛋白酶溶液，放置在 恒温实验室待用； (2) 大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地 分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在30粒左右，从获得受精卵到开始加入胰蛋白 酶溶液在3min内完成，然后往每个培养皿加入5mL胰蛋白酶溶液，每隔Imin轻轻震荡培养 皿5~10s，当培养皿中1/3左右的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水 清洗3次以终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成； (3) 受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微 镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄， 并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。
[0018] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，用胰蛋白酶溶液对大刺鳅 受精卵处理后进行持续性显微观察。2. 根据权利要求1所述的可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，所述胰 蛋白酶溶液的浓度是l~3g/L。3. 根据权利要求1所述的可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，所述胰 蛋白酶的比活为200~300U/mg。4. 根据权利要求1所述的可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，所述胰 蛋白酶溶液的用量为每个培养皿加3~5mL。5. 根据权利要求1所述的可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，所述用 胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理具体为：往装有大刺鳅受精卵的培养皿加入胰蛋白酶溶 液，每隔Imin震荡培养皿5~10s，当培养皿中1/3~1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋 白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以终止胰蛋白酶的作用。6. 根据权利要求1所述的可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，所述持 续性显微观察具体为：将受精卵放在体视显微镜进行连续观察，在每次卵裂和每个发育阶 段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄。7. 根据权利要求1所述的可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 胰蛋白酶溶液的配制：称量〇.2g胰蛋白酶于容器瓶中，加入IOOmL蒸馏水，加盖后 不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成2g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用； (2) 大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地 分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在25~35粒，从获得受精卵到开始加入胰蛋白 酶溶液在3min内完成，然后往培养皿加入胰蛋白酶溶液，每隔Imin震荡培养皿5~10s，当 培养皿中1/3~1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以 终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成； (3) 受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微 镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄， 并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。
【专利摘要】本发明属于水产动物繁殖生物学技术领域，公开了一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，是用胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理后进行持续性显微观察，可以包括胰蛋白酶溶液的配制、大刺鳅受精卵的获得及处理和受精卵的持续显微观察及日常管理等步骤。所用胰蛋白酶溶液的浓度是1~3g/L，用量是每个培养皿加3~5mL。本发明用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵进行处理后，使受精卵外膜变薄，透明，可进行持续性显微观察，观察过程视野清晰，结果可靠，与未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵相比，胚胎发育过程中，各发育阶段特征更清晰，尤其是放射状受精孔出现，红色动、静脉血循环系统的形成等特征，将鱼类胚胎发育研究水平提高到新的阶段，具有巨大的研究及参考价值。
【IPC分类】A01K61/00
【公开号】CN105123575
【申请号】CN201510448308
【发明人】骆明飞, 林义浩
【申请人】珠海市现代农业发展中心
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月27日