隆。使用运些 转移载体来用Cclll'cctin" (invitrogen?,USA)转染Sf21细胞。感染Sf21所得的重组杆状 病毒随后在细胞中传代两次，并用空斑测定方法来滴定。所得的杆状病毒表达组件的基因 结构如图8所示，图中展示了驱动Ac-ie-01cDNA或外源基因（例如，GFP)表达的启动子 的潜在不同组合。使用了不同表达组件来生成如图4至图7所示的实施例中的重组杆状病 〇
[0104] 实施例5 :制备克隆载体
[0105] 该克隆载体是含有本发明杆状病毒表达组件的小段DNA，可W向其中插入外源 DNA片段：用限制酶处理载体和外源DNA来制造相同突出末端，然后将片段相连。该克隆 载体的必要特征必须包括：合成多克隆位点（MCS)，用于促进外源基因W选定方向插入； 选择性标记，例如抗生素耐药性，W允许对阳性转化细胞进行选择；W及，功能性复制起点 (0RI)，用于细菌繁殖。
[0106] 实施例6:制备含有本发明杆状病毒表达组件的供体载体
[0107] 供体载体由含有杆状病毒表达组件并W适当限制酶克隆插入了外源基因的克隆 载体（例如PUC57质粒）组成。本发明杆状病毒表达组件是通过连接W下DNA序列来合成 的：（i)杆状病毒转录调控因子编码序列Ac-ie-01，位于启动子序列（例如PO化或地式启 动子）下游和服VTK多腺巧酸化信号上游；（ii)另一位点上的增强子序列（例如同源区 域虹1)，位于（iii)启动子序列（例如地2gpl0、plO、p6. 9pl0或po化）的上游；随后是用 于克隆所需基因的多克隆位点（MC巧和位于MCS下游的SV40多腺巧酸化信号（图1)。杆 状病毒表达组件侧翼为特异性限制位点（例如，5'端为Bglll和BstZ171，3'端为Bglll 和SgfI)，W促进亚克隆进入商用杆状病毒发生体系（基于转座，例如"Bac-to-Bac"'"体系 (invitrogen?)的转移载体中，或基于同源重组，例如"flashBAC?"(OxfordExpression Technologies?)、"Baculogold?"巧DBiosciences?)、"BacPAK6?" (Clontech?)、 "Bac-N-BlueDNA?" (invitrogen?)))的转移载体中（图 2 和图扣。
[0108] 使用化〇1和Spel限制位点将绿色巧光蛋白（GF巧的编码基因克隆入克隆载体的 MCS，生成供体质粒载体（图2)。
[0109] 实施例7 :制备含本发明杆状病毒表达组件的转移载体
[0110] 通过WBstZ171对供体载体的5'-侧翼位点进行酶切，及W甜al进行酶切，并将 其克隆入已用相同酶进行酶切的转移载体pFas巧ac?l，从而生成所述转移载体。在此情况 下，作为亚克隆的结果，杆状病毒表达组件的SV40多腺巧酸化信号被转移载体的SV40多腺 巧酸化信号所替换。除此之外，表达组件的所有元件均包含在该pFas巧ac转移载体中，取 代了原本商用转移载体的PO化启动子和MCS(图2)。
[01U] 实施例8 :使用"Biic-to-Bac'"体系生成含有本发明杆状病毒表达组件的杆状 病毒表达载体使用修饰后的转移载体pFas巧ac?l和该个体杆状病毒表达组件，通过 "Bac-to-BacK"杆状病毒表达体系来生成重组杆状病毒。更具体而言，使用修饰后的转移载 体来转化含有杆状病毒穿梭载体（杆粒）和辅助质粒的E.coli宿主菌DHlOBac?，并允许 该表达组件转座后生成重组杆粒。然后，使用C谢按试扣?，.W含有本发明杆状病毒表达组件 和GFP编码基因的重组杆粒的DNA来转染昆虫细胞，例如，Sf21细胞。转染后72小时，收 获细胞并获得第一代重组杆状病毒（图2)。该重组杆状病毒随后可W用常规试验方法进一 步扩增和/或滴定。可W使用类似步骤来W商用BEVSs提供的其他转移载体生成重组杆状 病毒（图3)。
[011引实施例9 :昆虫幼虫的饲育和感染
[0113] 粉纹夜蛾（Trichoplusiani)在二级生物安全条件下进行饲育。将卵置于专口设 计的含有人造虫食的幼虫发育笼中，并保持在22°C、控制湿度（50%)和光照周期（她/天） 的生长室中。
[0114] 使用五龄幼虫（蛹化前的末龄幼虫）进行所有的感染实验。每条幼虫的标准重量 为约120-130mg，在腹足（体腔前侧）附近注射5μ1稀释到指定空斑形成单位（P即）数量 /剂的重组杆状病毒。W96hpi处理幼虫。收集幼虫后立即冷冻在-20°C下储藏，直至用于 重组蛋白定量处理。使用BagMixer|'αnterscience?，法国）揽拌器进行2分钟均质化， 获得受杆状病毒感染的冷冻粉纹夜蛾幼虫的总可溶性非变性蛋白（TSNDPs)。提取缓冲液由 PBSlx、0. 01%TritonX-100、全蛋白酶抑制剂混合物（Roche?,德国）和25nMDTT组成。 [011引实施例10 :巧光分析
[0116] 用Tecan?GENios? (CA，USA)巧光分析仪（激发圧X]，485/发射圧m]，535)来对 约20μg来自受感染细胞的含不同量重组GFP蛋白的总可溶性蛋白进行分析和定量。
[0117] 实施例11 :免疫印迹分析
[0118] W15%SDS-PAGE凝胶来解析来自受重组杆状病毒感染的幼虫的总可溶性蛋 白部分（10μg)。用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色，或将凝胶转移到硝酸纤维膜。 W1 :1000的抗GFP单克隆抗体m油2515(Millipore?，USA)或微管蛋白抗血清灯5168 ; Sigma-Al化ich?)探测免疫印迹，并W1:2000稀释的抗鼠IgG-辣根过氧化物酶（HR巧标 记缀合物（KPL?，UK)作为二级抗体来显示免疫复合物。使用E化免疫印迹检测系统来检 测蛋白条带，并用QiemiDoc?XRS凝胶成像系统（QiemiDocTMXRSGelImagingSystem) 度i〇-Rad?，USA)进行分析。
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