] η为1至3的整数。
[0028] 所述细胞冻存保护组合物中，所述100质量份的细胞用养料成分包含下述质量份 数的组分： 一种或多种氨基酸 .5~15份; --种或多种盐 45~75份；
[0029] 一种或多种糖类 8~32份； 一种或多种维生素 （U~?.Ο份； 一种或多种蛋白质 0.5~10份。
[0030] 所述细胞冻存保护组合物中，所述具有通式结构R1-N+(CH3) 2-(CH2)n-R2的两性分 子为 CH3-N+ (CH3) 2-CH2-COO- 〇
[0031] 所述细胞冻存保护组合物中，所述具有通式结构R1-N+(CH3) 2-(CH2)n-R2的两性分 子中，（CH 2)n中的氢原子被羟基取代且ft*-CO(T。
[0032] 所述细胞冻存保护组合物中，所述细胞冻存保护组合物用于在冷冻保存期间保护 人类细胞或动物细胞;优选用于保护人类细胞或哺乳动物细胞。
[0033] 所述细胞冻存保护组合物中，所述人类细胞或哺乳动物细胞包括癌细胞、体细胞、 和干细胞的至少之一;优选所述体细胞为免疫细胞。
[0034] 所述细胞冻存保护组合物中，所述细胞冻存保护组合物用于在冷冻保存期间保护 人类细胞;优选所述人类细胞包括肺癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺细胞、造血干细胞、免疫细 胞、脐带间质干细胞、骨髓间充质干细胞、和淋巴癌细胞的至少之一。
[0035] 本申请的第二方面提供一种细胞冻存保护液，其为上述细胞冻存保护组合物的水 溶液，其中在所述细胞冻存保护液中所述两性分子的含量为〇. 1~20质量％，基于所述细胞 冻存保护液的总质量。
[0036] 所述细胞冻存保护液中，其中在所述细胞冻存保护液中所述两性分子的含量为4 ~1 〇质量％，基于所述细胞冻存保护液的总质量。
[0037] 本申请的第三方面提供一种对细胞进行冷冻保存的方法，其包括:将细胞悬浮于 上述细胞冻存保护液中，并置于冻存容器内，然后进行冷冻保存。
[0038] 所述对细胞进行冷冻保存的方法中，所述冷冻保存为超快速冷冻保存。
[0039] 所述对细胞进行冷冻保存的方法中，在进行所述冷冻保存后，使经冷冻保存的细 胞复苏，然后直接使用所述细胞、或以稀释方式使用所述细胞。
[0040] 所述对细胞进行冷冻保存的方法中，所述细胞的复苏成活率为至少70% ;优选所 述细胞的复苏成活率为80%-99%。
[0041 ] 所述对细胞进行冷冻保存的方法中，以I X IO4~I X IO9个细胞悬浮于I .Oml-5.Oml 所述细胞冻存保护液的浓度，将细胞悬浮于所述细胞冻存保护液中；优选以I XIO5~I X IO7 个细胞悬浮于1.5mL~I.SmL所述细胞冻存保护液的浓度，将细胞悬浮于所述细胞冻存保护 液中。
[0042]所述对细胞进行冷冻保存的方法中，所述冷冻保存的温度范围为-20°C至_196°C ; 优选为_80°C至-196°C。
[0043] 本申请的第四方面提供一种上述细胞冻存保护组合物在细胞冷冻保存中的用途， 所述细胞为人类细胞或动物细胞;优选所述细胞为人类细胞或哺乳动物细胞。
[0044] 所述用途中，所述人类细胞或哺乳动物细胞包括癌细胞、体细胞、和干细胞的至少 之一;优选所述体细胞为免疫细胞。
[0045] 所述用途中，所述细胞为人类细胞;优选所述人类细胞包括肺癌细胞、宫颈癌细 胞、乳腺细胞、造血干细胞、免疫细胞、脐带间质干细胞、骨髓间充质干细胞、和淋巴癌细胞 的至少之一。
[0046] 发明的效果
[0047] 本发明为了解决现有冻存保护细胞技术中的不足之处，提供一种无毒而又高效， 冻存方法简便，复苏细胞之后无需清洗可直接使用的细胞冻存保护组合物及使用其进行冻 存的方法。基于包含具有通式结构R 1-N+(CH3)2-(CH2) n-R2的两性分子的冻存保护组合物还 未见报道。因而本申请提供的细胞冻存保护组合物具有迫切的现实意义和应用价值，对科 学研究、生物医药、临床治疗等领域有着革命性的促进作用。
[0048]对本发明的技术效果综述如下：
[0049] 1)本发明所提供的细胞冻存保护组合物，由于其组分具有通式结构R1-N +(CH3)2-(CH2)n-R 2的两性分子具有调节细胞渗透压或者降低冰点的作用，因此可以在细胞冷冻过程 中起到保护作用，复苏后细胞成活率极高。
[0050] 2)本发明所提供的细胞冻存保护组合物其冻存步骤简便易行，优选直接放入冷冻 保存装置(包括，液氮或低温冷冻冰箱）中的冻存容器进行无需梯度冻存的超快速冷冻保 存，避免了传统"慢冻"储存技术中因为降温速率的不稳定而造成的细胞复苏成活率低下这 种情况，也极大减少了冻存设备的使用数量。
[0051] 3)本发明所提供的细胞冻存保护组合物有效成份具有通式结构R1-N+(CH 3)2-(CH2)n-R2的两性分子，本发明的细胞冻存保护组合物不包含以下物质:甘油、二氨基乙烷四 乙酸或其盐、二甲基亚砜、或卵黄，因此不同于传统的冻存保护剂，对细胞完全无害。本发明 所述的具有通式结构R 1-N+(CH3)2-(CH2) n-R2的两性分子包括从天然物质中分离得到的化合 物、以及在天然化合物的基础上进行改性或者衍生化而得到的化合物、以及人工合成的符 合上述通式结构的化合物等，化合物本身对于细胞无毒性。因此，无需复苏后为了去除有毒 性的冻存保护剂而反复冲洗细胞，为医疗临床领域，尤其是为细胞治疗等领域带来了广阔 的应用前景。
【附图说明】
[0052]图la:细胞在进行常规低温冷冻保存时受到冷冻损伤的原理示意图。
[0053]图Ib:细胞在进行常规低温冷冻保存时，本发明提供的细胞冻存保护组合物保护 细胞的原理示意图。
[0054]图2:不同细胞冻存保护组合物对人肺癌细胞GCL-82细胞的再贴壁测试图。
[0055]图3:不同细胞冻存保护组合物对人宫颈癌细胞Hela细胞的再贴壁测试图。
[0056]图4:不同细胞冻存保护组合物对人乳腺细胞MCF-10细胞的再贴壁测试图。
[0057]图5a:不同细胞冻存保护组合物对人肺癌细胞GCL-82细胞悬浮培养1天后再贴壁 测试图。
[0058]图5b:不同细胞冻存保护组合物对人肺癌细胞GCL-82细胞悬浮培养2天后再贴壁 测试图。
[0059]图5c:不同细胞冻存保护组合物对人肺癌细胞GCL-82细胞悬浮培养3天后再贴壁 测试图。
[0060]图6:不同浓度(质量％ )下的甜菜碱的DSC曲线图。
[00611图7:不同浓度(质量％ )下的左旋肉碱DSC曲线图。
[0062]图8:不同浓度(质量％ )下的磺基甜菜碱的DSC曲线图。
[0063]图9:不同浓度(质量％ )下的（3-丙烯酰胺基丙基)-(2-羧乙基)_二甲基铵盐的DSC 曲线图。
[0064]图10:不同浓度(质量％ )下的3-[[2_(甲基丙烯酰氧基）乙基]二甲基铵]丙酸内盐 的DSC曲线图。
[0065] 附图标记说明
[0066] 1 细胞
[0067] 2 冰晶
[0068] 3细胞冻存保护剂
【具体实施方式】
[0069] 以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但本发明不受这些具 体实施例的限制。
[0070] 如图Ia所示，细胞在低温冷冻保存时经常会受到冷冻损伤以致细胞死亡。1970年， Mazur提出了冷冻损伤的两种因素假设，如图Ia所示。当细胞1降低到冰点以下温度时，如果 降温速度过于缓慢，细胞外的冰晶2要早于细胞内先形成，于是导致细胞外渗透压骤升，由 于细胞内外渗透压差，细胞内的流动水会通过细胞膜大量渗出细胞外，导致细胞脱水而亡， 这就是所谓的溶质损伤(I);如果降温速率过快，细胞内的水分还没有时间渗出细胞就在细 胞内结冰，形成的冰晶对细胞内部的细胞器，蛋白，和膜结构等会产生致命的损伤，这就是 机械损伤(Π )。
[0071] 如图Ib所示，本发明提供的细胞冻存保护组合物所包含的细胞冻存保护剂3(具体 为，两性分子)具有调节渗透压、缓和应激反应、降低水的冰点，以及保护蛋白等作用，在细 胞冷冻保存中对避免两种冷冻损伤起到了决定作用，从而能够保护细胞成活。
[0072] 本申请的细胞冻存保护组合物包含细胞冻存保护剂和细胞用养料成分，其中的细 胞冻存保护剂包含一种或多种具有通式结构Ri-N +(CH3)2-(CH2)n-R 2的两性分子，例如，本申 请细胞冻存保护组合物中的细胞冻存保护剂为该两性分子、或该两性分子与其他常规冻存 保护剂的组合。
[0073] 本申请的细胞冻存保护组合物中，相对于100质量份的细胞用养料成分，以10-2530质量份包含上述两性分子，所述细胞冻存保护组合物不包含有害物质，如，对细胞有害 的物质，举例为甘油、二氨基乙烷四乙酸或其盐、二甲基亚砜、或卵黄。
[0074] 本申请的细胞冻存保护组合物中，相对于100质量份的细胞用养料成分，优选以 420~1120质量份包含上述两性分子。
[0075] 所述通式结构R1-N+(CH3)2-(CH 2)n-R2中，氮原子带有正电荷，R2为带有负电荷的基 团。其中，上述R1为碳数1至10的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基）丙烯酰胺基、 (甲基)丙烯酰氧基、烯基、羟基、羟基烷基、烷氧基、和卤素组成的组中的取代基取代，所述 取代是指基团中的氢原子被取代基取#
[0076] R2为选自由-COO_、-S〇4'_S〇2 组成的组中的任一种带负电荷 的基团。R3为选自由（甲基)丙稀醜氧基烷基、烷基、和烯基组成的组中的基团。
[0077] 所述(CH3)2和(CH2) n可各自独立地任选被选自由烷基、烯基、羟基、羟基烷基、烷氧 基、聚环氧烷基、和卤素组成的组中的取代基地取代，
[0078] η为1至10的整数。
[0079] 所述具有通式结构R1-N+(CH3)2-(CH 2)n-R2的两性分子属于含氮及含氧的两性分 子，该通式结构中可以具有多种取代基。本申请的细胞冻存保护组合物中，包含通式结构 R1-N+(CH3)2-(CH2) n-R2的两性分子，同时不包含甘油、二氨基乙烷四乙酸或其盐、二甲基亚 砜、或卵黄等有害组分。
[0080] 所述具有通式结构Ri-N+KHdMCHA-Rs的两性分子，包括从天然物质中分离得 到的化合物、在天然化合物的基础上进行改性或者衍生化而得到的化合物、以及人工合成 的符合上述通式结构的化合物。作为天然存在的两性分子，包括从天然物质中提取出来的 CH3-N+(CH3)2-CH2-CO(T(该化合物有时简称为"甜菜碱"或"天然甜菜碱"）、磷酸胆碱衍生物、 左旋肉碱等。
[0081] 具备该通式结构的两性分