轻轻吸取出 来，并在显微镜下观看细胞贴壁情况。
[0194] 3、实验结果
[0195] 实验结果示于图2-4。图2-4为不同种细胞(分别为人肺癌细胞GCL-82细胞、人宫颈 癌细胞He Ia细胞、和人乳腺细胞MCF-10细胞)在用不同冻存保护液，以相同细胞浓度下冷冻 保存后，用相应培养基稀释5倍后，直接培养进行贴壁测试。如图所示，包含本申请甜菜碱的 细胞冻存保护液的冻存保护液培养的细胞可再贴壁，形态以及增殖功能都未受到影响，而 传统DMSO保护液培养的细胞缩小，漂浮于底面上方，不能贴壁，从形态中可以看出细胞已死 亡。实验结果表明，利用本发明提供的细胞冻存保护液没有毒性，可稀释后或直接注入体 内，并且保存后的细胞功能完全正常。
[0196] 效果例7、冻存保护剂对细胞毒性测试
[0197] 1、实验设计
[0198] 使用本申请制备例7的细胞冻存保护液与传统的DMSO保护液以及普通培养基(对 照)对同一种人肺癌细胞GCL-82细胞进行毒性测试。
[0199] 2、实验方法
[0200] (1)取人肺癌细胞GCL-82细胞进行传代培养；（2)配制不同冻存保护液并进行细胞 计数，用普通培养基(基础培养基与胎牛血清体积比8:1)作为对照实验组；（3)收集约IX IO6个细胞，悬浮于15mL离心管中浸泡1-3天；（4)将浸泡后的细胞进行再贴壁测试。
[0201] 3、实验结果
[0202]实验结果示于图5。图5为人肺癌细胞GCL-82在用不同冻存保护组合物以相同细胞 浓度下悬浮培养1-3天后进行贴壁测试，如图所示，含2%甜菜碱的细胞冻存保护液培养的 细胞可在贴壁，形态以及增殖功能都与普通培养基(对照)悬浮培养无异，而传统DMSO保护 液培养的细胞缩小，漂浮于底面上方，不能贴壁，从形态中可以看出细胞已死亡。实验结果 表明，利用本发明提供的细胞冻存保护液较传统培养液(DMSO)相比，并无可观察到的毒性。 [0203]效果例8、冻存保护剂对冰点的影响测试
[0204] DSC(Differential Scanning Calorimeter)意为"差示扫描量热法"，指的是在程 序控制温度下，测量输给物质和参比物的功率差与温度关系的一种技术。DSC是在试样和参 比物容器下装有两组补偿加热丝，当试样在加热过程中由于热效应与参比物之间出现温差 Δ T时，通过差热放大电路和差动热量补偿放大器，使流入补偿电热丝的电流发生变化，当 试样吸热时，补偿放大器使试样一边的电流立即增大;反之，当试样放热时则使参比物一边 的电流增大，直到两边热量平衡，温差A T消失为止。换句话说，试样在热反应时发生的热量 变化，由于及时输入电功率而得到补偿，所以实际记录的是试样和参比物下面两只电热补 偿加热丝的热功率之差随时间t的变化关系。如果升温速率恒定，记录的也就是热功率之差 随温度T的变化关系。因此，当测量样品的环境温度上升，温度到达样品熔点时，就会有吸热 反应，补偿放大器使试样一边的电流立即增大，曲线图就会出现峰值。图6-10示出了不同浓 度下的甜菜碱类化合物水溶液中各具体化合物的DSC曲线，其中横坐标为温度（°C)，纵坐标 为功率差(W/g)，曲线中向下开始降低的温度点为结晶温度。
[0205]图6-10中0%为纯水，如图6-10可知，随着有效组分浓度的增加，水的冰点越来越 低，可证明甜菜碱类化合物所包含的各具体化合物对水冰点有降低作用。
[0206]以上制备例和效果例均是对于本发明具体实施方案和效果的示例，而不得被视为 对本发明的限制。本发明公开和提出的所有方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适 当改变原料和条件等环节实现，尽管本发明的方法已通过较佳实施例进行了描述，相关技 术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或重新组 合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1. 一种细胞冻存保护组合物，其包含一种或多种具有通式结构Ri-N+(CH3)2-(C出)n-R2的 两性分子、W及细胞用养料成分， 其中相对于100质量份的所述细胞用养料成分，所述两性分子为10~2530质量份； 所述细胞冻存保护组合物不包含W下物质：甘油、二氨基乙烧四乙酸或其盐、二甲基亚 讽、或卵黄， 在所述通式结构化-护(C出)2- ( C出)η-化中， 上述Ri为碳数1至10的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基）丙締酷胺基、（甲基） 丙締酷氧基、締基、径基、径基烷基、烷氧基、和面素组成的组中的取代基取代， R2为选自由-CO(T、-S〇4^-S〇3^和a成的组中的任一种带负电荷的基 团，所述R3为选自由（甲基)丙締酷氧基烷基、烷基、和締基组成的组中的基团， 所述(CH3 ) 2和(C出)η可各自独立地任选被选自由烷基、締基、径基、径基烷基、烷氧基、聚 环氧烷基、和面素组成的组中的取代基取代， η为1至10的整数。2. 根据权利要求1所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述通式结构Ri-N+(CH3)2- (C出）η-化中， 上述Ri为碳数1至5的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基)丙締酷胺基、（甲基)丙 締酷氧基、径基、径基烷基、烷氧基、和面素组成的组中的取代基取代， 上述R2为选自由-CO〇-、-S化-、和组成的组中的任一种基团，所述R3为 (甲基)丙締酷氧基烷基， 所述(CH3)2和(C出)η中的氨原子可各自独立地任选被选自由烷基、径基、径基烷基、烧氧 基、聚环氧烷基、和面素组成的组中的取代基取代， η为1至5的整数。3. 根据权利要求2所述的细胞冻存保护组合物，其中，相对于100质量份的所述细胞用 养料成分，所述两性分子为420~1120份;和 所述通式结构化-护(C出)2- (C出)η-化中， 上述Ri为碳数1至3的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基)丙締酷胺基、（甲基)丙 締酷氧基、径基、碳原子数1至5的径基烷基、和碳原子数1至5的烷氧基组成的组中的取代基 取代， 所述(C曲)2和（CH2)n中的氨原子可各自独立地任选被选自由碳原子数1至5的烷基、径 基、碳原子数1至5的径基烷基、碳原子数1至5的烷氧基、和聚环氧烷基组成的组中的取代基 取代， η为1至3的整数。4. 根据权利要求1至3任一项所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述100质量份的细胞 用养料成分包含下述质量份数的组分： -一种或多种氨基酸 5~15餘； 一种或多种盐 4:5~75傑； 一种或多种糖类 8~32份； 一种或多种维生素 0.1~1.0份； 一"种或多种蛋Η质 0.5~10份。5. 根据权利要求1至4任一项所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述具有通式结构化-Ν + ( C出）2-( C出)η-化的两性分子为C出-护（C出）2-C出-CO〇-。6. 根据权利要求1至4任一项所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述具有通式结构化-N + (CH3)2-(CH2)n-R2的两性分子中，（师)。中的氨原子被径基取代且化为-C00-。7. 根据权利要求1至6任一项所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述细胞冻存保护组 合物用于在冷冻保存期间保护人类细胞或动物细胞;优选用于保护人类细胞或哺乳动物细 胞。8. 根据权利要求7所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述人类细胞或哺乳动物细胞包 括癌细胞、体细胞、和干细胞的至少之一;优选所述体细胞为免疫细胞。9. 根据权利要求7或8所述的细胞冻存保护组合物，其中，所述细胞冻存保护组合物用 于在冷冻保存期间保护人类细胞;优选所述人类细胞包括肺癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺细 胞、造血干细胞、免疫细胞、厮带间质干细胞、骨髓间充质干细胞、和淋己癌细胞的至少之 〇10. -种细胞冻存保护液，其为根据权利要求1-9任一项所述的细胞冻存保护组合物的 水溶液，其中在所述细胞冻存保护液中所述两性分子的含量为0.1~20质量％，基于所述细 胞冻存保护液的总质量。11. 根据权利要求10所述的细胞冻存保护液，其中在所述细胞冻存保护液中所述两性 分子的含量为4~10质量％，基于所述细胞冻存保护液的总质量。12. -种对细胞进行冷冻保存的方法，其包括:将细胞悬浮于权利要求10或11所述的细 胞冻存保护液中，并置于冻存容器内，然后进行冷冻保存。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述冷冻保存为超快速冷冻保存。14. 根据权利要求12或13所述的对细胞进行冷冻保存的方法，其中，在进行所述冷冻保 存后，使经冷冻保存的细胞复苏，然后直接使用所述细胞、或W稀释方式使用所述细胞。15. 根据权利要求12至14任一项所述的方法，其中，所述细胞的复苏成活率为至少 70% ;优选所述细胞的复苏成活率为80%-99%。16. 根据权利要求12至15任一项所述的方法，其中，X 104~1 X 109个细胞悬浮于 1.0ml-5.0ml所述细胞冻存保护液的浓度，将细胞悬浮于所述细胞冻存保护液中；优选W1 X 105~1 X 107个细胞悬浮于1.5mL~1.8mL所述细胞冻存保护液的浓度，将细胞悬浮于所述 细胞冻存保护液中。17. 根据权利要求12至16任一项所述的方法，其中，所述冷冻保存的溫度范围为-20°C 至-196°C;优选为-80°C 至-196°C。18. -种根据权利要求1-9任一项所述的细胞冻存保护组合物在细胞冷冻保存中的用 途，所述细胞为人类细胞或动物细胞;优选所述细胞为人类细胞或哺乳动物细胞。19. 根据权利要求18所述的用途，其中，所述人类细胞或哺乳动物细胞包括癌细胞、体 细胞、和干细胞的至少之一;优选所述体细胞为免疫细胞。20. 根据权利要求18或19所述的用途，其中，所述细胞为人类细胞;优选所述人类细胞 包括肺癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺细胞、造血干细胞、免疫细胞、厮带间质干细胞、骨髓间充 质干细胞、和淋己癌细胞的至少之一。
【专利摘要】本申请涉及一种细胞冻存保护组合物、该组合物的用途以及细胞冻存的方法。所述细胞冻存保护组合物包含具有通式结构R1-N+(CH3)2-(CH2)n-R2的两性分子，其中上述R1为碳数1至10的直链或支链的烷基，其任选被取代基取代，R2为选自由-COO-、-SO4-、-SO3-、和组成的组中的任一种带负电荷的基团，所述R3为选自由(甲基)丙烯酰氧基烷基、烷基、和烯基组成的组中的基团；所述具有通式结构R1-N+(CH3)2-(CH2)n-R2的两性分子优选为甜菜碱类化合物。所述细胞冻存保护组合物能够无毒高效地实施细胞冻存，细胞复苏后成活率极高且无需梯度冻存；复苏细胞之后，可直接使用或稍稍稀释后使用该细胞。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105685016
【申请号】CN201610223983
【发明人】张雷, 杨静
【申请人】天津大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月8日